發(fā)布時(shí)間：2020-04-29 02:49

【摘要】：納米通道單分子技術(shù)是一種高度創(chuàng)新的技術(shù),它廣泛應(yīng)用于DNA測(cè)序、疾病診斷、藥物篩選、環(huán)境監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域。作為一種具有實(shí)時(shí)、靈敏、優(yōu)異選擇性和穩(wěn)定性等優(yōu)點(diǎn)的技術(shù),其受到廣泛關(guān)注。該項(xiàng)技術(shù)的原理是在施加電壓的情況下,分析物被驅(qū)動(dòng)到納米孔中,從而產(chǎn)生電流信號(hào),通過(guò)分析特征電流信號(hào)的持續(xù)時(shí)間、頻率、振幅等信息可以揭示檢測(cè)物的特性。DNA和RNA是生命遺傳物質(zhì),科學(xué)家們從來(lái)沒(méi)有停止關(guān)于DNA和RNA的研究。通過(guò)深入了解遺傳物質(zhì),對(duì)生命科學(xué)水平的提升具有重大意義。本文包括兩部分實(shí)驗(yàn)內(nèi)容,首先是研究單鏈DNA(ssDNA)在聚乙二醇(PEG)模擬的擁擠環(huán)境中穿過(guò)α-HL納米孔的動(dòng)態(tài)過(guò)程,其次是在單分子水平上研究前體RNA-21(pre-microRNA-21)和多肽相互作用的機(jī)理,主要研究?jī)?nèi)容具體如下:1文獻(xiàn)綜述簡(jiǎn)要綜述了納米孔單分子檢測(cè)技術(shù)的研究發(fā)展,檢測(cè)原理以及該項(xiàng)技術(shù)的應(yīng)用。2擁擠劑誘導(dǎo)DNA穿過(guò)納米孔的研究擁擠的細(xì)胞環(huán)境與許多重要的生物過(guò)程密切相關(guān)。然而,分子擁擠效應(yīng)對(duì)DNA穿孔行為的影響研究較少。我們使用納米孔單分子分析技術(shù)來(lái)量化PEG存在時(shí)ssDNA遷移的熱力學(xué)和動(dòng)力學(xué)常數(shù)。結(jié)果表明,ssDNA事件的頻率表現(xiàn)出對(duì)擁擠劑尺寸大小的非單調(diào)依賴性,而ssDNA事件的頻率和滯留時(shí)間隨著擁擠劑濃度的增加而單調(diào)增加。在存在PEG的情況下,ssDNA在納米孔中的遷移速率降低(從20μs/堿基至120μs/堿基),捕獲率提高了118.27倍。有趣的是,20%(w/v)PEG 4k對(duì)DNA-α-HL納米孔相互作用的影響最為顯著,此時(shí)ssDNA的吉布斯自由能和未加PEG環(huán)境中的ssDNA相差了16.27 kJ mol~(-1)。PEG 4k濃度為40%(w/v)時(shí),ssDNA-α-HL納米孔的平衡結(jié)合常數(shù)增加了764.5倍。該研究為擁擠條件下探索單分子動(dòng)力學(xué)提供了強(qiáng)有力的手段,而且納米孔分子擁擠效應(yīng)將在納米孔生物傳感和迫切需要捕獲分析物和控制遷移的納米孔DNA測(cè)序中具有廣泛的應(yīng)用。3基于α-HL蛋白納米通道對(duì)pre-microRNA-21和多肽相互作用的研究Pre-microRNA與小分子的相互作用對(duì)調(diào)控microRNA的水平有重要意義。本實(shí)驗(yàn)采用α-HL作為納米通道,通過(guò)對(duì)比多肽-pre-microRNA-21復(fù)合物和單獨(dú)的pre-microRNA-21產(chǎn)生的電流響應(yīng)信號(hào),可以成功觀察到多肽-pre-microRNA-21復(fù)合物的滯留時(shí)間比pre-microRNA-21的滯留時(shí)間增加了大概2倍,從419.50±33.29 ms到828.8±61.61 ms,因此結(jié)果表明pre-microRNA-21和多肽小分子發(fā)生了相互作用,導(dǎo)致pre-microRNA-21的結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定,解鏈時(shí)間增加。隨后將不同摩爾比的多肽和pre-microRNA-21反應(yīng)產(chǎn)生的復(fù)合物加到納米孔的cis端中,發(fā)現(xiàn)隨著參加反應(yīng)的多肽和pre-microRNA-21的摩爾比越大,反應(yīng)得到的pre-microRNA-21-多肽復(fù)合物越多,其在納米孔中的長(zhǎng)滯留時(shí)間的事件越多,平均滯留時(shí)間越大,當(dāng)兩種反應(yīng)物固定在某一個(gè)摩爾比后,復(fù)合物事件的平均滯留時(shí)間不再增加,此時(shí)多肽和pre-microRNA-21的反應(yīng)已經(jīng)達(dá)到了飽和。該實(shí)驗(yàn)為藥物篩選提供了一種新的平臺(tái)。
【圖文】：

圖 1.1 納米孔單分子技術(shù)檢測(cè)原理示意圖。.1.3 納米孔的分類以及 α-HL 納米孔的結(jié)構(gòu)納米孔大致可分為三類：生物納米孔[9-11]、固態(tài)納米孔[12-14]和復(fù)雜納米孔[15, 16]。納米孔各有優(yōu)缺點(diǎn):生物納米孔具有合適的內(nèi)徑以及可重現(xiàn)的自組裝能力，但是它易遭受破壞；固態(tài)納米孔的制備一般是人工合成的，所以是可控的，但是它有強(qiáng)烈音；復(fù)雜納米孔是固態(tài)納米孔和生物納米孔的結(jié)合，可以充分利用這兩類納米孔的。生物納米孔主要包括 α-溶血素（α-HL）、恥垢分枝桿菌孔蛋白 A（MspA）、phiNA 分子馬達(dá)等, 其通常嵌入脂質(zhì)體、脂質(zhì)膜或者聚合物膜中[11, 17]。固態(tài)納米孔包墨烯、三氧化二鋁、碳納米管等。第一個(gè)被構(gòu)建的納米孔是 α-HL 納米孔[18]。α-HL 是從葡萄球菌中分離得到的一肽毒素[19, 20]，可以自組裝嵌入磷脂雙分子層膜中。α-HL 納米孔有不對(duì)稱的蘑菇外形

α-HL的結(jié)構(gòu)
【學(xué)位授予單位】：西北大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：Q52;TB383.1

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本文編號(hào)：2644142