【摘要】：對于受損的細胞器以及一些細胞胞內(nèi)不需要的物質(zhì),細胞可通過自噬進行消除,進而為細胞自身代謝和某些細胞器的更新提供物質(zhì)基礎(chǔ),因此,自噬對細胞維持穩(wěn)態(tài)具有重要作用。細胞自噬包括非選擇性自噬和選擇性自噬。其中線粒體自噬(mitophagy)是選擇性自噬,受損的線粒體通過自噬途徑被清除,在線粒體質(zhì)量控制中線粒體自噬起重要作用。鞘氨醇磷酸膽堿(Sphingosylphosphorylcholine,SPC)是天然存在于血液中,由鞘磷脂在脫酰基酶的作用下產(chǎn)生的具有生物活性鞘脂類。研究發(fā)現(xiàn)SPC能調(diào)節(jié)癌細胞的增殖、遷移、凋亡。我們實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)SPC能促進A549細胞自噬,并且影響ROS和線粒體膜電位。線粒體膜電位降低,同時會伴隨線粒體自噬的增加。目前,SPC在線粒體自噬中的作用及機制還未搞清。對基因芯片結(jié)果的分析,我們發(fā)現(xiàn)并且證明SPC能夠增加MORN4和NR4A2的表達。MORN4(the membrane occupation and recognition nexus repeats 4 times)是包含4個MORN motif的蛋白。MORN motif廣泛存在于動物、植物和原生生物的蛋白中,數(shù)量從2-17不等。實驗室前期研究發(fā)現(xiàn),在H9c2心肌細胞中,SPC使MORN4的表達上調(diào),并且研究發(fā)現(xiàn)SPC通過JNK/MORN4/MFN2促進的自噬抑制其凋亡。MORN4在A549細胞中是否參與自噬并且是否能夠調(diào)節(jié)線粒體自噬尚不清楚。NR4A2(Nuclear receptor subfamily 4,group A,member 2)也叫 Nurr1,與NR4A1,NR4A3組成NR4A孤核受體家族。研究發(fā)現(xiàn),在腫瘤、肥胖,特別是神經(jīng)類疾病的發(fā)生中,NR4A2起到一定作用。如:在肺癌細胞中NR4A2與p53結(jié)合后,抑制凋亡。實驗室前期也證明ROS/NF-κB/NR4A2通路參與雙氧水經(jīng)自噬誘導(dǎo)小鼠心臟sca+細胞凋亡的過程,但是尚未搞清NR4A2在SPC通路中的作用。本研究中,我們發(fā)現(xiàn)A549經(jīng)SPC處理后,LC3-Ⅱ表達增加,mtDNA含量降低,Tim23表達降低,線粒體膜電位降低、線粒體合成激活基因PGC1B的表達增加等指標變化,這些結(jié)果證明了SPC能夠促進A549線粒體自噬。進一步發(fā)現(xiàn)SPC能夠上調(diào)其表達。利用MORN4慢病毒干擾質(zhì)粒降低其表達后,線粒體自噬進一步增加,說明MORN4可能對SPC的功能起到負反饋作用。由于降低MORN4的表達后,線粒體融合蛋白mfn2表達降低,因此推測MORN4可能通過調(diào)節(jié)mfn2影響線粒體自噬。通過對以上結(jié)果的分析,我們認為:A549細胞中SPC可誘導(dǎo)線粒體自噬,而線粒體自噬導(dǎo)致線粒體數(shù)量減少,同時發(fā)現(xiàn)了MORN4和PGC1B的表達上調(diào)。MORN4上調(diào)后,引起下游mfn2的表達,mfn2通過加強線粒體融合,使部分線粒體免于自噬以維持線粒體的基礎(chǔ)數(shù)量,表觀上產(chǎn)生自噬降低的狀況。同時,經(jīng)SPC處理或MORN4干擾抑制引起線粒體自噬增加后,誘導(dǎo)了包括PGC1B在內(nèi)的新線粒體合成途徑,以增加線粒體數(shù)量,維持細胞內(nèi)線粒體數(shù)量的動態(tài)平衡。在對NR4A2的研究中發(fā)現(xiàn),SPC也能增加NR4A2表達,與基因芯片檢測的結(jié)果一致;慢病毒轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒LV3-NR4A2,敲減NR4A2后,增加A549細胞線粒體自噬功能,與MORN4的研究結(jié)果類似,這一過程也可能是通過mfn2實現(xiàn)的;NR4A2過表達后A549細胞自噬增加,線粒體自噬降低。過表達NR4A2后加入SPC處理使LC3-Ⅱ水平增加,mtDNA含量和Tim23表達增加,PGC1B含量降低等,說明NR4A2參與到SPC促進A549細胞線粒體自噬中。
【圖文】：

圖２．ＳＰＣ上調(diào)ＭＯＲＮ４表達，ＣＣＣＰ能夠降低ＭＯＲＮ４表達

圖４．干擾ＭＯＲＮ４增加Ａ５４９細胞線粒體自噬。降低ＭＯＲＮ４表達后，１０ｐＭ逡逑ＳＰＣ／２0ｎＭ邋ＣＣＣＰ邋處理邋６ｈ邋“Ａ）ＱＰＣＲ邋檢測邋ｍｔＤＮＡ邋水平。（Ｂ）ＱＰＣＲ邋檢測邋ＰＧＣ１Ｂ逡逑水平。（Ｃ）邋ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ邋檢測邋ＭＯＲＮ４邋敲低后邋Ｔｉｍ２３邋表達，ＬＣ３－ＩＩ邋表達。（Ｄ，Ｅ）逡逑ＬＣ３－ＩＩ／ａｃｔｉｎ，邋Ｔｉｍ２３／ａｃｔｉｎ邋統(tǒng)計結(jié)果。（Ｆ，，Ｇ）免疫焚光檢測邋Ｔｉｍ２３邋表達。＊ｐ＜逡逑０．０５；＊＊ｐ＜０＿０１＿邋ｎ邋＝邋３。逡逑２２逡逑
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：Q25

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本文編號：2637962