【摘要】：脂肪酶作為重要的工業(yè)酶制劑之一,以其獨(dú)特的催化特性廣泛應(yīng)用在工業(yè)生產(chǎn)中。然而,工業(yè)生產(chǎn)往往伴隨高溫條件,天然脂肪酶的熱穩(wěn)定性難以滿足應(yīng)用要求,導(dǎo)致生產(chǎn)損失率高、生產(chǎn)成本增加。針對(duì)這種現(xiàn)狀,本研究利用基因融合手段、定點(diǎn)突變技術(shù)并結(jié)合結(jié)構(gòu)晶體分析對(duì)脂肪酶的熱穩(wěn)定性進(jìn)行改造,主要包括:1.利用基因融合手段對(duì)兩種脂肪酶進(jìn)行熱穩(wěn)定性改造,包括來源于華根霉的熱穩(wěn)定性較差的脂肪酶r27RCL和難以滿足工業(yè)生產(chǎn)要求的來源于嗜熱絲孢菌的脂肪酶TLL。本研究利用剛性接頭(Linker1,L1)和柔性接頭(Linker2,L2)將具有疏水性的自組裝雙親短肽SAP(AEAEAKAKAEAEAKAK)分別與兩種脂肪酶N端融合以提高蛋白質(zhì)表面的疏水性,從而增強(qiáng)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定程度。通過實(shí)驗(yàn)獲得了四株熱穩(wěn)定性提高的融合脂肪酶(SAP-L1-r27RCL、SAP-L2-r27RCL、SAP-L1-TLL、SAP-L2-TLL)。對(duì)脂肪酶r27RCL、SAP-L1-r27RCL、SAP-L2-r27RCL在60℃下進(jìn)行熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明:融合蛋白SAP-L1-r27RCL和SAP-L2-r27RCL的半衰期較野生型分別提高1.75倍和1.20倍。對(duì)脂肪酶TLL、SAP-L1-TLL、SAP-L2-TLL在80℃下進(jìn)行熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)融合蛋白SAP-L1-TLL和SAP-L2-TLL半衰期較野生型分別提高1.50倍和1.17倍。此外,催化反應(yīng)動(dòng)力學(xué)結(jié)果表明四種融合脂肪酶的底物親和性和催化效率較野生型均有明顯提高。綜上,對(duì)脂肪酶N端進(jìn)行SAP短肽融合改造可以提高其熱穩(wěn)定性,且剛性接頭較柔性接頭效果更佳。2.提取脂肪酶r27RCL晶體結(jié)構(gòu)中所有氨基酸的溫度因子(B-factor),并進(jìn)行歸一化處理,發(fā)現(xiàn)氨基酸序列(63-TKWDCK-68)的B-factor較大,說明該區(qū)域極不穩(wěn)定。下載自NCBI數(shù)據(jù)庫中所有耐熱性/嗜熱真菌脂肪酶(共92條),并進(jìn)行多序列比對(duì),統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)耐熱/嗜熱真菌脂肪酶在此區(qū)域的保守序列為63-TNITCT-68。比較兩段序列,設(shè)計(jì)突變位點(diǎn)K64N、W65I、D66T、K68T,并進(jìn)行定點(diǎn)突變和異源表達(dá),最終獲得兩株熱穩(wěn)定性提高得突變脂肪酶(r27RCL-K64N、r27RCL-K68T)。在50℃條件下對(duì)野生型和突變型脂肪酶耐受120 min,結(jié)果表明:r27RCL-K64N和r27RCL-K68T相對(duì)剩余酶活較野生型分別提高37.88%和48.20%;在60℃條件下對(duì)野生型和突變型脂肪酶耐受90 min,r27RCL-K64N與r27RCL-K68T的半衰期較野生型分別提高了2.4倍和3.0倍;而突變體r27RCL-W65I和r27RCL-D66T的熱穩(wěn)定性較野生型下降。此外,突變脂肪酶的底物親和性和催化效率較野生型均有明顯提高。通過對(duì)突變體進(jìn)行結(jié)構(gòu)模建探索突變體耐熱性改變的原因:突變位點(diǎn)K64N和K68T仍保持了野生型脂肪酶該位點(diǎn)與周圍氨基酸的氫鍵相互作用,而突變氨基酸(N64和T68)具有相比于野生型氨基酸更短的側(cè)鏈,使得該位點(diǎn)的浮動(dòng)減小、穩(wěn)定性增強(qiáng);當(dāng)將W65突變?yōu)镮65后,該位點(diǎn)與周圍氨基酸的氫鍵相互作用消失,致使其穩(wěn)定性下降。3.通過對(duì)脂肪酶r27RCL進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)研究發(fā)現(xiàn)該脂肪酶含有一個(gè)未成對(duì)的半胱氨酸C204。利用在線軟件Disulfide by Design 2.0預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)中能夠形成二硫鍵的成對(duì)氨基酸,結(jié)果表明若將距C204 3.8?的T201突變?yōu)镃201,C201和C204能夠形成二硫鍵。實(shí)驗(yàn)以r27RCL基因?yàn)橐吧?經(jīng)定點(diǎn)突變、異源表達(dá)獲得一株熱穩(wěn)定性明顯提高的突變脂肪酶r27RCL-T201C。分別在50℃和60℃條件下對(duì)野生型和突變型脂肪酶進(jìn)行耐受,r27RCL-T201C的半衰期較野生型分別提高了1.25和1.50倍。此外,r27RCL-T201C的底物親和性和催化效率較野生型有明顯提升。然而,突變體r27RCL-T201C的最適溫度相比于野生型下降5℃。結(jié)構(gòu)模建發(fā)現(xiàn)突變位點(diǎn)T201C靠近影響脂肪酶最適溫度的酪氨酸殘基(Y200),新增二硫鍵局部結(jié)構(gòu)域的穩(wěn)定性的影響可能導(dǎo)致Y200的不穩(wěn)定性增強(qiáng),導(dǎo)致突變脂肪酶r27RCL-T201C最適溫度降低。
【圖文】：

增加 PCR 反應(yīng)中的突變頻率，定頻率隨機(jī)地?fù)饺氲綌U(kuò)增的基因中，進(jìn)些突變?nèi)后w通過合適的載體克隆出來[41,模版，利用易錯(cuò) PCR 進(jìn)行隨機(jī)突變后出一株酶突變株在 50℃下酶活是 37℃下：是一種基于 PCR 技術(shù)，利用多次、反核苷酸的方法[44]。DNA 重組技術(shù)主要基因家族打碎成一定長(zhǎng)度的片段，后以在 PCR 延伸程序中利用部分同源性進(jìn)行延伸，同時(shí)來源不同的基因間也會(huì)發(fā)生，直至擴(kuò)出全長(zhǎng)基因[45,46](如圖 1.1)。antarctica lipase B 進(jìn)行家族改組，獲得了 20 倍，同時(shí)也獲得了一種在 45℃的肪酶 B[47]。

一種畢赤酵母常用的表達(dá)載體Figure1.2Acommonexpressionvectorofpichiapastoris
【學(xué)位授予單位】：云南師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：Q55

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2637959