【摘要】：早期生長應(yīng)答基因1(early growth response gene1,EGR1),是早期生長應(yīng)答基因家族成員。EGR1基因的表達(dá)激活與細(xì)胞的生長、分化活動相關(guān)。由于在許多原癌基因、抑癌基因及生長因子基因的啟動子區(qū)域中存在EGR1蛋白的結(jié)合位點(diǎn),提示EGR1可能在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮作用。本實(shí)驗(yàn)室以前的研究表明,細(xì)胞骨架蛋白-細(xì)絲蛋白A(Filamin A,FLNA)能被定位于細(xì)胞的核仁區(qū),抑制RNA聚合酶I(Pol Ⅰ)及聚合酶Ⅲ(Pol Ⅲ)指導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄和細(xì)胞增殖活動。最近,利用FLNA敲低細(xì)胞系完成mRNA-Seq分析表明,FLNA敲低促進(jìn)早期生長應(yīng)答基因1(EGR1)的mRNA表達(dá)。這些結(jié)果提示EGR1可能參與調(diào)控Pol Ⅰ及Pol Ⅲ指導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄。因此本課題旨在研究EGR1在Pol Ⅰ及Pol Ⅲ指導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄中的作用,探索EGR1參與調(diào)控Pol Ⅰ及Pol Ⅲ基因轉(zhuǎn)錄的機(jī)制。為了完成本課題的研究,克隆EGR1 shRNA慢病毒表達(dá)載體并與包裝載體共轉(zhuǎn)染細(xì)胞,建立EGR1單敲低穩(wěn)定細(xì)胞系和FLNA-EGR1雙敲低穩(wěn)定細(xì)胞系。利用RT-qPCR及Western Blot方法檢測EGR1單敲低和FLNA-EGR1雙敲低穩(wěn)定細(xì)胞系中Pol Ⅰ及Pol Ⅲ基因的轉(zhuǎn)錄,結(jié)果表明,EGR1敲低抑制Pol Ⅰ及Pol Ⅲ指導(dǎo)的一部分基因轉(zhuǎn)錄。通過四唑鹽比色法(MTT法)和細(xì)胞計(jì)數(shù)法發(fā)現(xiàn),EGR1促進(jìn)細(xì)胞增殖活動。為了進(jìn)一步證明EGR1對Pol Ⅰ及Pol Ⅲ基因轉(zhuǎn)錄和細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)作用,建立EGR1過表達(dá)穩(wěn)定細(xì)胞系。利用RT-qPCR、Western Blot、細(xì)胞計(jì)數(shù)以及MTT等方法分別檢測EGR1過表達(dá)細(xì)胞中Pol Ⅰ及Pol Ⅲ基因轉(zhuǎn)錄和細(xì)胞增殖,結(jié)果表明,EGR1過表達(dá)促進(jìn)Pol Ⅰ及Pol Ⅲ指導(dǎo)的一部分基因轉(zhuǎn)錄和細(xì)胞增殖。綜合上述數(shù)據(jù),EGR1能夠充當(dāng)正調(diào)控因子調(diào)節(jié)Pol Ⅰ及Pol Ⅲ基因轉(zhuǎn)錄和細(xì)胞增殖。使用RT-qPCR和Western Blot方法檢測EGR1敲低細(xì)胞系中參與調(diào)節(jié)Pol Ⅰ和Pol Ⅲ基因轉(zhuǎn)錄的信號通路蛋白表明,EGR1敲低穩(wěn)定細(xì)胞系中PTEN表達(dá)顯著升高,RhoA表達(dá)顯著降低,p53等其他因子表達(dá)無明顯變化。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示EGR1可能通過影響PTEN及RhoA信號通路因子的表達(dá)調(diào)節(jié)Pol Ⅰ和Pol Ⅲ基因轉(zhuǎn)錄和細(xì)胞增殖。綜上所述,本課題發(fā)現(xiàn)了EGR1差異性調(diào)節(jié)Pol Ⅰ及Pol Ⅲ指導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄及細(xì)胞增殖,EGR1可能通過影響PTEN及RhoA等信號通路因子的表達(dá)調(diào)節(jié)上述活動。本課題的研究結(jié)果拓寬了EGR1在細(xì)胞中的調(diào)節(jié)作用,為了解RNA Pol Ⅰ及Pol Ⅲ指導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄和腫瘤細(xì)胞增殖的機(jī)制提供新視角。
【學(xué)位授予單位】：武漢科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：Q75

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本文編號：2626014