【摘要】：富含鳥嘌呤序列的RNA結(jié)合因子1(GRSF1)是RNA結(jié)合蛋白(RBP)家族的成員之一。GRSF1存在于細(xì)胞核,細(xì)胞質(zhì)和線粒體中,在細(xì)胞質(zhì)和線粒體中通過參與RNA的加工,轉(zhuǎn)運(yùn)和翻譯來調(diào)節(jié)RNA代謝。然而,其在成肌分化中的作用尚未得到研究。在本研究中,我們證明了 GRSF1在線粒體中的表達(dá)及其對線粒體功能的影響與小鼠骨骼肌成肌細(xì)胞C2C12的分化負(fù)相關(guān)。在C2C12細(xì)胞內(nèi)干涉GRSF1能夠促進(jìn)成肌分化。相反,過表達(dá)GRSF1則能夠抑制細(xì)胞分化進(jìn)程。與此同時(shí),GRSF1表達(dá)量的改變并不影響分化早期標(biāo)志物MyoD的表達(dá)或細(xì)胞增殖。進(jìn)一步的研究表明,GRSF1是通過直接靶向線粒體谷胱甘肽過氧化物酶4(m-GPX4)調(diào)節(jié)成肌分化。m-GPX4是細(xì)胞氧化還原狀態(tài)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,能夠調(diào)節(jié)線粒體ROS(mtROS)的水平,而mtROS在成肌分化過程中具有非常重要的作用。干涉GRSF1或者m-GPX4均能夠?qū)е耺tROS水平的上升和成肌分化進(jìn)程加速,而過表達(dá)GRSF1或者m-GPX4則會降低mtROS水平以及抑制成肌分化進(jìn)程。同時(shí),當(dāng)細(xì)胞ROS被抑制時(shí),成肌細(xì)胞的分化能力被抑制,干涉GRSF1或者m-GPX4引發(fā)的促分化效果也會被抑制。我們的研究結(jié)果揭示了骨骼肌生成過程中GRSF1的關(guān)鍵功能在于其對肌肉氧化還原穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)。
【圖文】：

圖１內(nèi)源性ＧＲＳＦ１邋ｍＲＮＡ及蛋白表達(dá)量逡逑（Ａ）邋Ｃ２Ｃ１２細(xì)胞分化過程示意圖；（Ｂ）邋Ｃ２Ｃ１２細(xì)胞中內(nèi)源性ＧＲＳＦ１邋ｍＲＮＡ和蛋逡逑的表達(dá)量。＊ｐ邋＜０．０５，＊＊ｐ邋＜０．０１，＜０．００１，ｎｓ，無顯著性。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１邋Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ邋ＧＲＳＦ１邋ｍＲＮＡ邋ａｎｄ邋ｐｒｏｔｅｉｎ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ逡逑（Ａ）邋Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ邋ｄｉａｇｒａｍ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ邋ｐｒｏｃｅｓｓ邋ｏｆ邋ｍｏｕｓｅ邋ｍｙｏｂｌａｓｔｓ邋Ｃ２Ｃ１２；邋（Ｂ）逡逑ｔｉｖｅ邋ｌｅｖｅｌｓ邋ｏｆ邋ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ邋ＧＲＳＦ１邋ｎｉＲＮＡ邋ａｎｄ邋ｐｒｏｔｅｉｎ邋ｌｅｖｅｌｓ邋ｉｎ邋ｍｏｕｓｅ邋ｍｙｏｂｌａｓｔｓ邋Ｃ２Ｃ１２逡逑ｓｕｒｅｄ邋ｏｖｅｒ邋ｔｉｍｅ．邋＊ｐ邋＜邋０．０５，邋＊＊ｐ邋＜邋０．０１，＊＊＊ｐ邋＜邋０．００１，ｎｓ，ｎｏｔ邋ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ．逡逑．３．２邋ＧＲＳＦｌ調(diào)控Ｃ２Ｃ１２細(xì)胞分化逡逑通過使用針對ＧＲＳＦ１的兩個(gè)不同的ｓｉＲＮＡ邋（ｓｉＧＲＳＦｌ＃ｌ，ｓｉＧＲＳＦｌ＃２）降低ＧＲＳＦｌ逡逑達(dá)量來探索ＧＲＳＦｌ的功能作用（圖２Ａ）。肌球蛋白重鏈（ＭＹＨＣ）是成肌細(xì)胞的逡逑分化標(biāo)志物，融合指數(shù)代表分化程度。在成肌分化過程中，ＧＲＳＦ１的敲低可以顯著逡逑肌球蛋白重鏈３邋（ＭＹＨ３）在ｍＲＮＡ表達(dá)量（圖２Ｂ），，針對ＭＹＨＣ的免疫染色可逡逑出蛋白水平也顯著升高，融合指數(shù)顯著上升（圖２Ｃ）。相反，ＧＲＳＦｌ的過表達(dá)（圖逡逑抑制了分化期間ＭＹＨ３的轉(zhuǎn)錄和翻譯，融合指數(shù)顯著下降（圖２Ｅ，２Ｆ）。逡逑

圖３邋ＧＲＳＦｌ對ＭＹＯＤ及增殖的影響逡逑（Ａ）轉(zhuǎn)染后在指定的分化時(shí)間點(diǎn)（ＤＯ，Ｄ１和Ｄ３）邋ＭＹＯＤ邋ｍＲＮＡ的相對水平。（Ｂ）逡逑上：轉(zhuǎn)染后誘導(dǎo)分化之前（ＤＯ）的ＭＹＯＤ蛋白免疫印跡。ＢＣＡ測定加載等量的蛋白逡逑質(zhì)，Ｐ－ａｃｔｉｎ邋（ＡＣＴＢ）是加載對照。下：相對于上樣對照的ＭＹＯＤ蛋白質(zhì)水平的定量。逡逑（Ｃ）在ＧＲＳＦ１沉默或過表達(dá)２４小時(shí)后，ＥｄＵ邋（紅色）摻入Ｃ２Ｃ１２細(xì)胞的免疫熒逡逑光，在ＥｄＵ標(biāo)記３小時(shí)后固定細(xì)胞。箱型圖，在十個(gè)視野中測量的ＥｄＵ＋核的百分比。逡逑比例尺，１００邋（ｉｍ。ｎｓ，無顯著性。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋３邋Ｅｆｆｅｃｔ邋ｏｆ邋ＧＲＳＦｌ邋ｏｎ邋ＭＹＯＤ邋ａｎｄ邋ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ逡逑（Ａ）邋Ｒｅｌａｔｉｖｅ邋ｌｅｖｅｌｓ邋ｏｆ邋ＭＹＯＤ邋ｍＲＮＡ邋ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ邋ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ邋ａｔ邋ｔｈｅ邋ｉｎｄｉｃａｔｅｄ邋ｔｉｍｅ邋ｏｆ逡逑ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ邋（ＤＯ，邋Ｄ１邋ａｎｄ邋Ｄ３）．邋（Ｂ）邋Ｕｐｐｅｒ：邋Ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔ邋ｆｏｒ邋ＭＹＯＤ邋ｐｒｏｔｅｉｎ邋ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ逡逑ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ邋ｉｍｍｅｄｉａｔｅｌｙ邋ｐｒｉｏｒ邋ｔｏ邋ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ邋（ＤＯ）．邋Ｅｑｕａｌ邋ａｍｏｕｎｔｓ邋ｏｆ邋ｐｒｏｔｅｉｎ逡逑ｗｅｒｅ邋ｌｏａｄｅｄ邋ｂａｓｅｄ邋ｏｎ邋ＢＣＡ邋ａｓｓａｙ，邋Ｐ－ａｃｔｉｎ邋（ＡＣＴＢ）邋ｗａｓ邋ａ邋ｌｏａｄｉｎｇ邋ｃｏｎｔｒｏｌ；邋Ｌｏｗｅｒ：邋ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ逡逑ｏｆ邋ｔｈｅ邋ＭＹＯＤ邋ｐｒｏｔｅｉｎ邋ｌｅｖｅｌｓ邋ｒｅｌａｔｉｖｅ邋ｔｏ邋ｔｈｅ邋ｌｏａｄｉｎｇ邋ｃｏｎｔｒｏｌ．邋（Ｃ）邋Ｉ
【學(xué)位授予單位】：東北林業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：Q344

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本文編號：2625893