【摘要】：綠原酸水解活性酶類泛指可以水解綠原酸的一類酶,主要包括綠原酸水解酶和阿魏酸酯酶2類。綠原酸水解活性酶類可實現(xiàn)對綠原酸的生物降解,在食品和醫(yī)藥等行業(yè)有著廣闊的應(yīng)用前景。實驗室前期篩得一株高產(chǎn)綠原酸水解活性酶類的曲霉屬真菌SD14,其野生酶具有良好的穩(wěn)定性和底物親和力,但綠原酸水解活力較低(4.35 U/g)。本研究完成了對該菌株的全基因組測序,根據(jù)注釋信息篩選,對可能編碼綠原酸水解活性酶類的4個基因進行克隆,并實現(xiàn)其在大腸桿菌E.coli BL21(DE3)中的可溶性表達。經(jīng)誘導(dǎo)條件優(yōu)化,最終獲得2個具有綠原酸水解活性的重組酶reFAE1和reFAE2,并進一步對其酶學(xué)性質(zhì)進行探究。主要研究內(nèi)容及結(jié)果如下:(1)交叉比較菌株SD14的ITS區(qū)、鈣調(diào)蛋白和β-微管蛋白基因序列信息,構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹,提高菌種鑒別分辨率,最終確定其為棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus),與日本曲霉(A.japonicus)親緣關(guān)系近。采用第三代單分子測序技術(shù)完成了對該菌株的全基因組測序、組裝和功能注釋工作,所得基因組序列總長為36.18Mb,包含18條scaffolds,GC含量為50.11%,組裝質(zhì)量遠超過已有報道。(2)以實驗室篩得的曲霉屬真菌(A.aculeatus SD14)的總RNA反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板,設(shè)計引物擴增獲得基因組中可能具有綠原酸水解活性的4個注釋基因(GME3292/7542/2693和11122),最終在E.coli原核表達系統(tǒng)中獲得可溶性表達。其中2個基因工程菌GME3292-pET28a(+)/E.coli BL21(DE3)和GME11122-pET28a(+)/E.coli BL21(DE3)表達的重組酶檢測到綠原酸水解活性,分別命名為reFAE1和reFAE2。(3)從誘導(dǎo)劑濃度、誘導(dǎo)時機、誘導(dǎo)溫度和誘導(dǎo)時長4個方面對GME3292-pET28a(+)/E.coli BL21(DE3)和GME11122-pET28a(+)/E.coli BL21(DE3)進行誘導(dǎo)發(fā)酵條件優(yōu)化,確定最佳誘導(dǎo)條件為:OD_(600)=1.2,誘導(dǎo)溫度為20°C,誘導(dǎo)時長為20 h,IPTG濃度分別為:0.04和0.02 mmol/L。最終綠原酸水解活力分別為246.37和340.95 U/g,是原始菌株的56.64和78.38倍,較已報道最高綠原酸水解酶活提高43%。(4)通過親和鎳柱層析色譜法對重組酶進行分離純化,純化所得reFAE1和reFAE2均為同源二聚體,其單體相對分子質(zhì)量均在55 kDa左右。重組酶對4種模型底物均有水解活力,其中對咖啡酸甲酯的水解活性最高,香豆酸甲酯次之,阿魏酸甲酯和芥子酸甲酯的水解活性相對較低,對天然底物綠原酸的水解活性與香豆酸甲酯接近。根據(jù)底物特異性初步推測,reFAE1和reFAE2均屬于C型阿魏酸酯酶。(5)reFAE1和reFAE2水解綠原酸的最適溫度分別為60℃和50℃,最適pH均為7.0,在30~50℃條件下具有良好的熱穩(wěn)定性。reFAE1和reFAE2分別在pH 3.0~8.0和pH 3.0~10.0條件下穩(wěn)定。Mn~(2+)和Ca~(2+)對reFAE2有一定程度的激活作用。EDTA處理對重組酶綠原酸水解活性基本沒有影響,一價金屬離子對酶活無顯著影響,二價金屬離子會對酶活造成一定程度的抑制,三價金屬離子處理后酶活損失嚴重。重組酶對綠原酸底物親和能力較好,K_m分別為79.85μmol和105.98μmol。
【圖文】：

第一章 緒論1 綠原酸及其對食品加工的影響廣義的綠原酸指由一個或多個咖啡酸和奎尼酸縮合而成的酯類，根據(jù)置和數(shù)目可大致分為單酯、二酯、三酯和四酯4類[1]，，目前已從自然界植發(fā)現(xiàn)的單酯類綠原酸異構(gòu)體有綠原酸（5-咖啡酰奎尼酸）、隱綠原酸（4-奎尼酸）、新綠原酸（3-咖啡�？崴幔�3 種。狹義的綠原酸（Chlorogid，CGA）僅指由單個咖啡酸與奎尼酸縮合形成的縮酚酸，是植物有氧莽草酸途徑代謝產(chǎn)生的一種苯丙素類化合物[2]，其化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖 1-1 所A 廣泛存在于自然界植物體中，在咖啡豆、蘋果、土豆、向日葵種子及（如杜仲、金銀花等）中含量尤為豐富。研究表明，CGA 是重要的生物質(zhì)[3]，具有抗菌[4, 5]、抗病毒[6, 7]、抗氧化[8]、降血壓、降血脂[9]和興奮中10]等多種生理功能。

圖 1-2 ChlH 催化反應(yīng)式Fig. 1-2 The catalyzed reaction formulas of ChlH2007 年，Benoit 等[26]分離純化得到 ChlH，對其蛋白質(zhì)一級序列進行比，結(jié)果顯示 ChlH 與真菌產(chǎn)羧酸酯酶和膽酰酯酶的氨基酸序列具有相對較似性，約為 41%和 35%。推測其屬于 α/β 折疊水解酶家族，其催化三聯(lián)中心由 204位絲氨酸、325 位谷氨酸和 390 位組氨酸組成。預(yù)測結(jié)構(gòu)模型所示，其中包含 11 個 β-折疊和 9個 α-螺旋結(jié)構(gòu)。
【學(xué)位授予單位】：江南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：Q78;TS201.25

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本文編號：2625888