【摘要】：乳糖是哺乳動(dòng)物乳汁及乳制品中存在的主要碳水化合物,當(dāng)人們飲用牛奶后,在消化過程中乳糖必須被β-半乳糖苷酶催化水解為半乳糖和葡萄糖才能被機(jī)體吸收利用。據(jù)報(bào)道,世界上約有十分之一的人由于體內(nèi)缺乏β-半乳糖苷酶而患有乳糖不耐受癥;飲用牛奶后,身體會(huì)出現(xiàn)腹瀉、嘔吐等不良反應(yīng)。其中,β-半乳糖苷酶具有很大的商業(yè)利用情景,性質(zhì)優(yōu)良的β-半乳糖苷酶在生產(chǎn)生活中具有重要的實(shí)用價(jià)值。β-半乳糖苷酶屬于糖苷水解酶的一種,廣泛存在于自然界中。根據(jù)氨基酸序列的相似性,將β-半乳糖苷酶歸入五種糖苷水解酶(Glycoside hydrolases,GH)家族,包括1、2、35、42和59家族。其中,部分β-半乳糖苷酶除了具有水解活性以外,還具有轉(zhuǎn)糖基活性。目前,對(duì)β-半乳糖苷酶的研究較多,但尚未有來源于動(dòng)物胃腸道且具有轉(zhuǎn)糖基活性的β-半乳糖苷酶報(bào)道,以及很少有報(bào)道具有耐鹽性的β-半乳糖苷酶;由于β-半乳糖苷酶被廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)、醫(yī)學(xué)和生化分析等鄰域,耐鹽與否與其運(yùn)用前景息息相關(guān)。本論文研究的β-半乳糖苷酶來源于滇金絲猴糞便微生物宏基因組DNA,通過PCR克隆得到基因galRBM20_1、galRBM20_2、galRBM20_13和galRBM20_15,配合pEASY-E2載體和宿主Escherichia coli BL21(DE3)菌種構(gòu)建原核表達(dá)系統(tǒng),分別對(duì)其進(jìn)行異源表達(dá)和純化,并對(duì)純化后的重組酶galRBM20_1、galRBM20_2、galRBM20_13和galRBM20_15進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)研究,結(jié)果表明:(1)重組酶galRBM20_1最適pH為5.0,在pH 4.0-7.0之間仍能保持70%及其以上的活性,在pH 5.0-8.0的范圍內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性;最適溫度為45℃,37℃和45℃下具有良好的穩(wěn)定性;大多數(shù)金屬離子和化學(xué)試劑對(duì)該酶的活性都具有激活作用;其耐鹽性較強(qiáng),當(dāng)反應(yīng)環(huán)境中有適當(dāng)濃度的NaCl或是經(jīng)一定濃度范圍內(nèi)的NaCl處理后,能明顯提高酶的活力。(2)重組酶galRBM20_2最適pH為7.0,在pH 7.0-9.0之間仍能保持70%及其以上的活性;在pH 5.0-7.0的范圍內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性;該酶溫度穩(wěn)定性良好,最適溫度為45℃,55℃處理1 h后還具有45%以上的活性;大多數(shù)金屬離子和化學(xué)試劑對(duì)該酶的活性都具有激活作用;該酶具有良好的耐鹽性,經(jīng)一定濃度范圍內(nèi)的NaCl處理后,酶的活力明顯提高。(3)重組酶galRBM20_13最適pH為7.0,在pH 7.0-9.0之間仍能保持70%及其以上的活性;最適溫度為45℃,在37℃、45℃、50℃和55℃下穩(wěn)定性良好;1 mM的β-mercaptoethanol、Mg~(2+)、Fe~(2+)對(duì)該酶的活性具有明顯的激活作用;該酶具有良好的耐鹽性,且一定濃度范圍內(nèi)的NaCl處理能提高酶的活力。(4)重組酶galRBM20_15最適pH為8.0,在pH 7.0-9.0之間仍能保持70%及其以上的活性;galRBM20_15受pH的激活作用較強(qiáng),在pH 5.0-10.0的范圍內(nèi)處理1 h后,酶活均在100%以上,其中pH 10處理1h后,相對(duì)酶活達(dá)到180%以上;最適溫度為45℃,50℃和55℃下穩(wěn)定性良好;1 mM的β-mercaptoethanol、Mg~(2+)、Mn~(2+)對(duì)該酶的活性具有明顯的激活作用;該酶具備一定的耐鹽性,當(dāng)反應(yīng)環(huán)境中有2 M的NaCl存在時(shí),仍具有55%的活性。TLC檢測結(jié)果表明,重組酶galRBM20_1、galRBM20_2、galRBM20_13和galRBM20_15除了能將乳糖水解為半乳糖和葡萄糖以外,還具有轉(zhuǎn)糖基活性;為此,本研究獲得的β-半乳糖苷酶不僅能很好的水解乳清、干酪和牛乳(pH 5.0-7.0),而其在具有鹽溶液的反應(yīng)中能發(fā)揮良好的反應(yīng)潛能,較適應(yīng)β-半乳糖苷酶的廣泛用途。
【圖文】：

第 1 章 緒論2圖1.1 糖苷水解酶催化機(jī)制[2]Fig. 1.1 Glycosidases mechanisms[2]1.1 β-半乳糖苷酶的研究概況β-半乳糖苷酶的研究促使了微生物學(xué)的快速發(fā)展。例如，法國的雅各(Jacob)和莫諾德(Monod)[6]基于大腸桿菌β-半乳糖苷酶的研究，提出了乳糖操縱子的理論和酶生物合

的 C-1 位置，使乳糖的β-D-(1, 4)、β-D-(1, 6)或β-D-(1, 3)糖苷鍵斷裂，生成葡萄糖和半乳糖基-酶復(fù)合物。然后，溶液中的水分子向陰離子巰基提供一個(gè)質(zhì)子(H+)，形成帶負(fù)電荷的底物(含 OH-)進(jìn)攻酶活性中心半乳糖基的 C-1 位置，形成半乳糖，并將電子傳遞給咪唑基，酶分子還原，繼續(xù)參與下一個(gè)酶促反應(yīng)[54,56]。過程為：(1) 酶-乳糖→半乳糖苷-酶+葡萄糖，(2) 半乳糖苷-酶+受體→半乳糖苷-受體+酶。反應(yīng)第二步在酶的作用下，β-半乳糖苷被轉(zhuǎn)移到含羥基的親核受體(水和糖類都可作為受體)上，受體為水時(shí)生成半乳糖，為水解反應(yīng)，受體為乳糖或半乳糖等糖類時(shí)，則為轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)。乳糖為二糖，在水解為單糖半乳糖和葡萄糖的過程中，當(dāng)羥基獲得質(zhì)子，且底物進(jìn)攻半乳糖的 C-1 位置時(shí)，形成的產(chǎn)物即為 GOS[56,57]。如第二步反應(yīng)，若羥基的受體是乳糖水解產(chǎn)生的半乳糖或葡萄糖，則生成聚半乳二糖[58]；若羥基的受體是乳糖，則生成低聚半乳三糖；生成的三糖也可以作為羥基的受體，生成四糖；以此類推，，可生成更高的低聚半乳糖，如圖 1.2 所示。通常情況下，當(dāng)反應(yīng)體系中乳糖濃度低于水的濃度時(shí)，反應(yīng)類型主要為水解[43,59]，生成的低聚半乳糖很少。因此，如果要提高低聚半乳糖的產(chǎn)量，可通過提高反應(yīng)體系中底物(受體)的濃度或降低水的濃度實(shí)現(xiàn)[60]。
【學(xué)位授予單位】：云南師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：Q78;Q55

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 孫常文;周清濤;王超;龐明利;楊海軍;;低聚半乳糖概述及其功能效果原理分析[J];山東食品發(fā)酵;2015年03期

2 李丕武;王升;梁榮榮;吳祥坤;;微生物與酶技術(shù)在新型功能糖開發(fā)中的應(yīng)用[J];氨基酸和生物資源;2014年04期

3 段緒果;孫曉軍;吳敬;;β-半乳糖苷酶全細(xì)胞催化制備低聚半乳糖工藝優(yōu)化[J];食品與發(fā)酵工業(yè);2014年12期

4 楊卉新;杜海廷;田玉民;;乳糖酶及其基因的研究進(jìn)展[J];安徽農(nóng)業(yè)科學(xué);2014年17期

5 鄭健;張琦;魏云林;林連兵;;來源于熱泉宏基因組的β-半乳糖苷酶及其特征[J];食品與發(fā)酵工業(yè);2014年05期

6 劉芳寧;梁琪;張炎;張衛(wèi)兵;;微生物β-半乳糖苷酶的研究進(jìn)展[J];中國釀造;2012年12期

7 陳堅(jiān);劉龍;堵國成;;中國酶制劑產(chǎn)業(yè)的現(xiàn)狀與未來展望[J];食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào);2012年01期

8 徐金龍;玄明;曹宇婷;;乳糖酶研究進(jìn)展[J];養(yǎng)殖技術(shù)顧問;2011年10期

9 張莉;李慶章;田雷;;β-半乳糖苷酶研究進(jìn)展[J];東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào);2009年07期

10 黃循柳;黃仕杰;郭麗瓊;林俊芳;;宏基因組學(xué)研究進(jìn)展[J];微生物學(xué)通報(bào);2009年07期

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前3條

1 尤生萍;β-半乳糖苷酶發(fā)酵制備工藝研究與酶制劑劑型開發(fā)[D];天津大學(xué);2014年

2 蔣孝燕;轉(zhuǎn)糖基活性β-半乳糖苷酶產(chǎn)生菌株篩選、克隆表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì)研究[D];江南大學(xué);2010年

3 許可;來源于節(jié)桿菌的β-D-半乳糖苷酶的克隆表達(dá)及其酶學(xué)性質(zhì)的研究[D];廈門大學(xué);2008年

本文編號(hào)：2621689