【摘要】：食品會(huì)因芽孢的存在而引發(fā)腐敗及一些安全問(wèn)題,但是芽孢卻又很難被各種殺菌方法殺滅,所以找到殺滅芽孢的路徑迫在眉睫。造成芽孢死亡的關(guān)鍵之處在于芽孢皮層肽聚糖水解,由于芽孢萌發(fā)、核心水化、皮層裂解酶被激活,所以芽孢抗性消失,故將皮層裂解酶分離純化出來(lái)就顯得尤為重要。從天然菌種中提取皮層裂解酶,工作量大、難以分離純化且產(chǎn)率還低,所以本文通過(guò)基因工程操作技術(shù),構(gòu)建了皮層裂解酶CwlJ的基因工程菌,以獲得大量的皮層裂解酶,為后續(xù)試驗(yàn)提供了原材料,為推動(dòng)CwlJ水解肽聚糖進(jìn)而殺滅芽孢并應(yīng)用于食品殺菌奠定了基礎(chǔ)。本文研究了枯草桿菌芽孢皮層裂解酶CwlJ基因的克隆及酶生物信息學(xué)分析、皮層裂解酶CwlJ的誘導(dǎo)表達(dá)及分離純化、皮層裂解酶CwlJ水解肽聚糖產(chǎn)物分析。主要研究?jī)?nèi)容及結(jié)論如下:(1)為了構(gòu)建含有皮層裂解酶CwlJ基因的克隆,依據(jù)查到的基因序列,設(shè)計(jì)CwlJ的特異引物,合成CwlJ基因片段后與pCZN 1質(zhì)粒連接,重組子pCZN 1-CwlJ轉(zhuǎn)化Topl0感受態(tài)細(xì)胞,陽(yáng)性克隆測(cè)序結(jié)果采用NCBI和ExPASy網(wǎng)站中的各種信息分析工具,并結(jié)合DNAMAN軟件對(duì)CwlJ基因序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析。結(jié)果表明:CwlJ蛋白是一種堿性、不穩(wěn)定、親水、非分泌性蛋白;其二級(jí)結(jié)構(gòu)中a-螺旋占26.06%,β-折疊占21.83%,β-轉(zhuǎn)角占4.93%,無(wú)規(guī)則卷曲占47.18%;CwlJ基因表達(dá)的酶蛋白形成包涵體的可能性為68.11%;系統(tǒng)進(jìn)化分析中枯草芽孢桿菌皮層裂解酶CwlJ與蘇云金芽孢桿菌皮層裂解酶CwlJ、蘇云金芽孢桿菌Bt18247皮層裂解酶CwlJ親緣關(guān)系較近。以上結(jié)果為后續(xù)CwlJ基因的異源表達(dá)、純化與功能研究提供了參考信息。(2)為了獲得大批量的皮層裂解酶CwlJ,運(yùn)用IPTG誘導(dǎo)重組菌表達(dá)目的蛋白CwlJ,SDS-PAGE和Western-Blot檢驗(yàn)重組皮層裂解酶的表達(dá)情況,并用親和層析法純化重組蛋白CwlJ。研究發(fā)現(xiàn)0.5 mM的IPTG能實(shí)現(xiàn)CwlJ基因的大量表達(dá),純化后的重組皮層裂解酶CwlJ分子量為17.9KD,最適溫度為40℃、最適pH值為5,比酶活力146.67U/mg,相比從天然芽孢中提取出來(lái)的皮層裂解酶,重組皮層裂解酶的活性提高了 2倍,保證了皮層裂解酶CwlJ進(jìn)一步水解肽聚糖實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行。(3)為了進(jìn)一步了解酶水解肽聚糖的產(chǎn)物特點(diǎn),先提取了芽孢皮層肽聚糖,然后分析了在酶CwlJ的參與下肽聚糖的水解產(chǎn)物。研究發(fā)現(xiàn),水解產(chǎn)物的SDS-PAGE圖中共有7條蛋白條帶,質(zhì)譜數(shù)據(jù)顯示水解產(chǎn)物中有蛋白質(zhì)1300種,分子量以20～40KD居多,肽段2609個(gè);氨基酸分析中顯示水解產(chǎn)物中有四種游離氨基酸,分別是賴(lài)氨酸、精氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸;水解液中蛋白質(zhì)含量0.1600 mg/mL、NAG含量0.1625 mg/mL;元素分析中表明水解產(chǎn)物中C、N比為2.95%,C、H 比為 5.88%。本研究構(gòu)建了皮層裂解酶CwlJ的基因工程菌,成功誘導(dǎo)表達(dá),并純化出有活性的CwlJ,為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供了研究材料。肽聚糖水解產(chǎn)物分析中蛋白種類(lèi)1300余種,不排除肽聚糖提取不純的原因,對(duì)水解產(chǎn)物進(jìn)行分析,其分析結(jié)果為后繼研究肽聚糖水解進(jìn)而殺滅芽孢的其他殺菌技術(shù)提供對(duì)照與參考信息。
【圖文】：

２．２．１皮層裂解酶Ｃｗ／Ｊ基因的克隆逡逑根據(jù)己知的Ｃｗ／Ｊ基因序列，合成目的基因ＣＷ。合成產(chǎn)物進(jìn)行１％瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果逡逑見(jiàn)圖２－２。由圖２－２可知，所得產(chǎn)物大小約為４５０邋ｂｐ，目的條帶上方出現(xiàn)的陰影可能是引物不特逡逑－１０－逡逑

■逡逑（注：Ｍ為ＤＮＡ分子量標(biāo)準(zhǔn)；１泳道為Ｃｗ／Ｊ基因ＰＣＲ產(chǎn)物）逡逑圖２－２邋ＣＶ／Ｊ基因ＰＣＲ擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖逡逑Ｆｉｇ．邋２－２邋Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｏｇｒａｍ邋ｏｆ邋ＰＣＲ邋ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ｐｒｏｄｕｃｔ邋ｏｆ邋ＣｗｌＪ邋ｇｅｎｅ逡逑目的基因Ｃｗ／Ｊ克隆至質(zhì)粒ｐＣＺＮｌ后的雙酶切驗(yàn)證，，結(jié)果見(jiàn)圖２－３。由圖２－３可知，顯示所逡逑切掉的片段和克隆序列大小一致，可確定Ｃｗ／Ｊ己經(jīng)插入質(zhì)粒ｐＣＺＮｌ中。逡逑ｂｐ邐Ｍ邐１逡逑一逡逑０．５邋Ｋｂ邋—焌逡逑（注：Ｍ為ＤＮＡ分子量標(biāo)準(zhǔn)；１泳道為雙酶切結(jié)果）逡逑圖２－３雙酶切鑒定結(jié)果逡逑Ｆｉｇ．邋２－３邋Ｒｅｓｕｌｔｓ邋ｏｆ邋ｄｏｕｂｌｅ邋ｅｎｚｙｍｅ邋ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ邋ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ逡逑測(cè)序結(jié)果見(jiàn)圖２－４。由圖２－４可知，該克隆基因全長(zhǎng)４４０邋ｂｐ，與克隆序列一致，且開(kāi)放閱讀逡逑框架正確。由此得出結(jié)論ｐＣＺＮ邋１－ＣＶ／Ｊ重組載體構(gòu)建成功［７６］。逡逑１邐ＡＴＴＣＣＴＴＴＡＡ邋ＣＧＣＴＴＣＡＡＡＡ邋ＴＣＴＧＴＡＡＡＧＣ邋ＡＣＧＣＣＡＴＡＴＣ邋ＧＣＣＧＡＡＡＧＧＣ邋ＡＣＡＣＴＴＡＡＴＴ逡逑６１邐ＡＴＴＡＡＧＡＧＧ丁邋ＡＡＴＡＣＡＣＣＡＴ邋ＧＡＡＴＣＡＣＡＡＡ邋Ｇ丁ＧＣＡＴＣＡＴＣ邋ＡＴＣＡＴＣＡ１｜ＣＡＴＡＴｇ｜ｇＣＡＧＴＴ逡逑１２１邋ＧＴＴＣＧＴＧＣＧＡ邋ＣＣＡＧＣＧＣＧＧＡ邋ＴＧＴＴＧＡＴＣＴＧ邋ＡＴＧＧＣＧＣＧＴＣ邋ＴＧＣＴＧＣＧＴＧＣ邋ＧＧＡＡ
【學(xué)位授予單位】：寧夏大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：Q78

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本文編號(hào)：2621539