【摘要】：硫化氫(H2S)是一種新型的氣體信號分子,參與生物體內(nèi)多個生理過程,包括凋亡、血管穩(wěn)態(tài)和再生、神經(jīng)傳遞調(diào)節(jié)、細胞保護以及炎癥調(diào)節(jié)等方面。H2S在體內(nèi)可以轉(zhuǎn)化為硫烷硫,二者通常共存,最近的很多研究表明,在某些生物學現(xiàn)象中,可能硫烷硫才是潛在的信號分子。硫烷硫(sulfane sulfur)在體內(nèi)普遍存在,扮演著調(diào)節(jié)和抗氧化的角色,主要包括有機過硫化物(R-SSH),有機多硫化物(R-SSnH或RSSnR,n≥2)和無機多硫化物(H2Sn,n≥2)三類。硫烷硫和硫醇有很大的不同,后者主要表現(xiàn)為親核性,而硫烷硫既有親核性又有親電性。硫烷硫可由H2S的硫氧化途徑、半胱氨酸或N-乙酰半胱氨酸的代謝途徑產(chǎn)生,其中間產(chǎn)物GSSH是線粒體和異養(yǎng)細菌硫化物氧化途徑中的關(guān)鍵產(chǎn)物�；钚粤蛲榱蛲ㄟ^對細胞內(nèi)功能蛋白的半胱氨酸殘基進行修飾,形成過硫化物(R-SSH)的形式后改變酶活,或以信號傳遞的方式調(diào)節(jié)生物體的活性,從而影響生理過程。硫氰酸酶(rhodanese),廣泛存在于多種細胞內(nèi),催化機制之一就是通過形成酶的中間體R-SSH,將硫烷硫從硫代硫酸鹽轉(zhuǎn)移給氰化物從而達到氰化物解毒的目的。越來越多的證據(jù)表明活性硫烷硫在體內(nèi)的重要性,而更好地了解與生物密切相關(guān)的硫烷硫的生化特性將有助于推動這一領(lǐng)域的進一步發(fā)展。目前用于硫烷硫的檢測方法有很多,包括硫化學發(fā)光法、離子色譜法、多硫化物(polysulfides,H2Sn)衍生物的高效液相色譜分析和H2Sn敏感熒光染料的應用。這一類的方法都是基于化學反應來檢測,目前還未見一種能夠?qū)崟r探測活性硫烷硫的非化學反應方法報道。H2S的濃度至關(guān)重要,其生物毒性表現(xiàn)為明顯的劑量效應,高濃度的H2S會對線粒體中細胞色素c氧化酶(cytochrome c oxidase)的活性產(chǎn)生抑制作用,進而影響電子傳遞,抑制呼吸作用等。有些異養(yǎng)細菌能夠氧化硫化氫生成多硫化物(在硫醌氧化還原酶SQR和過硫化物雙加氧酶PDO的作用下),進一步氧化成亞硫酸鹽和硫代硫酸鹽,氧化代謝產(chǎn)物的毒性則遠小于H2S。Cupriavidus pinatubonensis JMP134是 β-變形菌綱的革蘭氏陰性菌,在芳香族化合物降解方面和生物技術(shù)等方面應用廣泛。課題組的前期研究發(fā)現(xiàn),JMP134中存在一個硫氧化基因簇pdo-sqr,操縱子受到上游Fis家族的σ54依賴型轉(zhuǎn)錄因子FisR的調(diào)控。FisR具有增強子蛋白bEBP的典型結(jié)構(gòu),蛋白內(nèi)部分為三個結(jié)構(gòu)域,R結(jié)構(gòu)域的三個半胱氨酸是感應硫烷硫的關(guān)鍵調(diào)控位點;AAA+結(jié)構(gòu)域具有水解酶活性,D結(jié)構(gòu)域可以和啟動子上游的序列結(jié)合。但FisR的調(diào)控模型尚不清楚,結(jié)構(gòu)域之間如何相互作用也不確定。為了解決以上問題,本文開發(fā)了一種快速、靈敏的熒光掃描光譜法對硫烷硫的熒光特性、FisR的調(diào)控機制及RhoD的催化功能開展以下研究內(nèi)容:1.用熒光分光光度計設置同步掃描激發(fā)光和發(fā)射光,對硫烷硫進行熒光同步掃描光譜(resonance synchronous spectroscopy,RS2)的研究。通過對 14種含硫化合物的熒光同步掃描結(jié)果分析發(fā)現(xiàn),只有當分子內(nèi)部含有親電形式的S=S時,硫烷硫才有RS2的特異性光譜;用RS2的方法,可以用于硫烷硫的生化性質(zhì)的分析,如pKa的測定,反應動力學速率測定,小分子蛋白過硫化物pH依賴的硫烷硫活性等。依據(jù)這一發(fā)現(xiàn),對無機多硫化物的生化特性進行了研究,研究結(jié)果顯示無機多硫化物在低濃度下極不穩(wěn)定,在生理條件(pH7.4)下,會和胞內(nèi)的GSH快速發(fā)生反應,半衰期約為1min。質(zhì)子化的GSSH是親電體,具有熒光同步光譜的特征峰。解離的GSS'是親核體,易被氧化,不具備該特征峰。利用該特性確定了 GSSH的解離常數(shù)pKa為6.9。在pH7.4條件下,GSSH/GSS'和H202的二級反應速率比H2S/HS'和H202高50倍,說明類似于GSSH/GSS'的活性硫烷硫可能在胞內(nèi)起主要的抗氧化作用。半胱氨酸的過硫化修飾是細胞內(nèi)蛋白的常見修飾形式,參與了多種代謝過程,以負責氰化物解毒的兩種硫氰酸酶RhoD為模型,研究了蛋白活性位點口袋的功能,結(jié)果顯示半胱氨酸在胞內(nèi)的過硫化修飾狀態(tài)也存在兩種形式:a.去質(zhì)子化的形式(R-SS-),不顯示RS2特征峰,不能和亞硫酸鹽反應;b.質(zhì)子化形式(R-SSH),有RS2特征峰,可以和亞硫酸鹽反應生成硫代硫酸鹽。用RS2的方法對大腸桿菌及其重組菌進行了全細胞分析,研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),熒光同步掃描RS2光譜的形狀、強度和硫烷硫的種類、濃度及緩沖體系pH都密切相關(guān),這在一定程度能夠揭示活性硫烷硫在胞內(nèi)分布的物質(zhì)種類和相對含量。RS2是一種利用物質(zhì)的熒光特性快速、靈敏、簡便的測定活性硫烷硫的方法,可以揭示活性硫烷硫的新的生化性質(zhì),利用該方法測定的GSSH的pKa、動力學反應參數(shù)、H2Sn在不同pH值下的分布等,有望填補硫烷硫研究領(lǐng)域的空白。2.硫氧化途徑是異養(yǎng)菌C pinatubonensis JMP1 34產(chǎn)生硫i烷硫的重要來源之一,我們發(fā)現(xiàn)了一種新的依賴于σ54的轉(zhuǎn)錄因子,它既是硫化物感應器,又是JMP134中硫化物氧化途徑的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。當胞內(nèi)多余的H2S轉(zhuǎn)化為多硫化物時,FisR激活σ54依賴的操縱子轉(zhuǎn)錄,來降低H2S的濃度,減少對細胞的毒害作用。我們首先確定了 FisR蛋白的三個半胱氨酸是感應多硫化物的關(guān)鍵位點,進一步研究了 FisR結(jié)合在pdo-sqr 操縱子上游的具體位點及其通過ATP水解酶活性激活下游基因轉(zhuǎn)錄的方式。轉(zhuǎn)錄因子可以通過多種方式調(diào)節(jié)自身的聚合狀態(tài),常見的調(diào)節(jié)方式有D結(jié)構(gòu)域結(jié)合在操縱子上游或R結(jié)構(gòu)域的磷酸化。FisR轉(zhuǎn)錄因子的蛋白聚合是依賴R結(jié)構(gòu)域的,蛋白表達后隨即形成六聚體結(jié)合在JMP134的pdo-sqr操縱子上游的調(diào)控區(qū):大多數(shù)σ54依賴型調(diào)控因子對于AAA+結(jié)構(gòu)域的水解酶活性是負調(diào)控的,而我們的研究證明FisR屬于多硫化物激活后的正調(diào)控。針對以上研究結(jié)果,提出了 FisR轉(zhuǎn)錄因子對外界硫化物壓力產(chǎn)生快速應答的“待命狀態(tài)”模型,該模型的核心機制是:本底表達的少量SQR蛋白將外源多余的硫化物轉(zhuǎn)化為多硫化物(Km值較低,反應易發(fā)生),激活FisR轉(zhuǎn)錄因子,FisR通過自身的水解酶活性起始下游基因的轉(zhuǎn)錄。從生物信息學的角度分析FisR同源的調(diào)控蛋白可能是含有pdo-s科r基因簇的異養(yǎng)菌抵抗外界環(huán)境中硫化物壓力的一個共同的策略。3.釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是研究的比較多的模式生物,在利用硫代硫酸鹽為硫源生長時比利用硫酸鹽時產(chǎn)生更多的酒精。S.cerevisiae.的細胞內(nèi)有五種硫轉(zhuǎn)移酶,分別是Rd11、Rd12、Tuim1、Ych1和Uba4,其中Rd11和Rd12負責將硫代硫酸鹽的硫烷硫轉(zhuǎn)移給硫受體形成過硫化物和亞硫酸鹽,Tuim1(tRNA-thiouridine modification protein 1)在Urm1 系統(tǒng)的硫轉(zhuǎn)移過程中起著重要的作用。DUF442是Cupriavidus pinanibonensis JMP134 中CpSQR(硫醌氧化還原酶,Reut 3588)的一個結(jié)構(gòu)域,不但具有硫氰酸酶的性質(zhì),還在硫氧化系統(tǒng)中參與硫化物的代謝,一方面它能加速SQR的產(chǎn)物多硫化物和GSH的反應速度,另一方面催化GSSH和S032'的反應。DUF442結(jié)構(gòu)域由128個氨基酸組成,其中有2個半胱氨酸殘基,分別位于34位和94位,只有94位的半胱氨酸為保守的活性位點。將與GSSH孵育后的DUF442蛋白進行質(zhì)譜鑒定,結(jié)果顯示34位和94位的半胱氨酸都會被修飾,且修飾的蛋白過硫化物在pH7.4條件下能夠檢測到明顯的熒光同步光譜,但94位半胱氨酸突變的DUF442突變體沒有熒光光譜。利用RS2的方法測定了 Cys34-SSH的pKa為6.29。因此在生理條件下,只有野生型的和34位半胱氨酸突變的C94-SSH才能將硫烷硫轉(zhuǎn)移給亞硫酸鹽形成硫代硫酸鹽。以 Rd12 和 DUF442 為研究模型,分別選擇 Saccharowyces cerevisiae(PDB ID:3DIP,分辨率0.98 A,相似性40%),和 Neisseriaa meningitidis z2491(PDB ID:2F46,分辨率1.41 A,相似性39%)的結(jié)構(gòu)為模板進行了 3D同源建模的結(jié)構(gòu)預測和生物信息學分析,發(fā)現(xiàn)RhoD蛋白的催化活性位點呈口袋形狀,保守的半胱氨酸位于口袋的底部,周圍的堿性氨基組成了一個強靜電場結(jié)構(gòu),因此蛋白過硫化物protein-SSH在口袋內(nèi)部會呈現(xiàn)質(zhì)子化狀態(tài),而不會解離成protein-SS-的形式,因此具有RS2熒光同步掃描光譜和親電性。本文首次解析了Rd12過硫化物(RhoD-SSH)的晶體結(jié)構(gòu),分辨率為2.47 A,RhoD-SSH是硫轉(zhuǎn)移反應的關(guān)鍵中間體,精氨酸殘基對催化位點起關(guān)鍵作用,突變后會顯著影響RhoD的酶活性,thiosulfate孵育的Rd12蛋白的質(zhì)譜鑒定結(jié)果顯示Rd12的氨基酸被過硫化修飾形成Rd12-SSH的形式,和復合物蛋白晶體結(jié)構(gòu)的分析結(jié)果一致。綜上,本論文分析了活性硫烷硫的代表化合物,包括多硫化物和過硫化物的理化性質(zhì)和熒光特性等,并對與硫烷硫密切相關(guān)的代表性蛋白(硫代謝調(diào)控蛋白和硫轉(zhuǎn)移蛋白)在體內(nèi)的生理功能進行了研究,為進一步揭示硫烷硫在生物體內(nèi)參與調(diào)節(jié)作用和信號傳遞的機制提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。
【圖文】：

ＣＢＳ主要存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)和肝臟中，３－ＭＳＴ主要位于線粒體內(nèi)，逡逑與半胱氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ｃｙｓｔｅｉｎｅ邋ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，ＣＡＴ）共同產(chǎn)生Ｈ２Ｓ［９，１０，１１，１２］。逡逑圖１．１ｂ概述了哺乳動物Ｈ２Ｓ內(nèi)源產(chǎn)生的途徑［１３］。逡逑Ｈ２Ｓ在細菌體內(nèi)的產(chǎn)生方式主要有三種：ａ．硫酸鹽還原細菌（ｓｕｌｆａｔｅ－ｒｅｄｕｃｉｎｇ逡逑ｂａｃｔｅｒｉａ，邋ＳＲＢ）的硫酸鹽還原作用；ｂ．硫細菌（ｓｕｌｆｉｉｒ邋ｂａｃｔｅｒｉａ）對單質(zhì)硫的還原；逡逑ｃ．異養(yǎng)微生物胞內(nèi)產(chǎn)生Ｈ２Ｓ。逡逑Ｒｎｙｉｒｕｎｍｅｎｕｌ邋ＨｉＳ邐ＭｔｃｒｏｂＵｌＨｊＳ逡逑  邋一逡逑Ｉ＞ＳＲ逡逑ＭＶ逡逑ｔ邋？邋Ｔ邋Ｖ邐３ＭＳＴ逡逑（ａ）邐（ｂ）逡逑Ｉｎｌｒａｉｒｌｌｕｌａｒ邋Ｈ？Ｓ逡逑＜邋Ｉ）邋ＰｒｏｄｕｔｉｌＫｉｎ邐（２）邋Ｍｏｒａｇｒ邐（３）邋Ｉ邋Ｖｇｒａ？ｌ？ｔｈｉｎ逡逑ＣＢＳ逡逑圖１．１丨丨２Ｓ的來源丨１３｜。（ａ）環(huán)境中的Ｈ２Ｓ來源與火山、硫礦、熱泉等；（ｂ）微生物產(chǎn)生Ｈ２Ｓ，逡逑亞硫酸鹽還原酶還原硫酸鹽到比５，某些細菌利用和哺乳動物同源的ＣＢＳ，邋ＣＳＥ和３－ＭＳＴ酶逡逑降解半胱氨酸產(chǎn)生Ｈ２Ｓ；邋（ｃ）內(nèi)源性Ｈ２Ｓ的產(chǎn)生途徑主要有半胱氨酸降解、硫烷庫的活性硫逡逑轉(zhuǎn)化為Ｈ２Ｓ、線粒體中硫氧化代謝途徑；逡逑Ｆｉｇ．邋１．１邋Ｓｏｕｒｃｅｓ邋ｏｆ邋ｈｙｄｒｏｇｅｎ邋ｓｕｌｆｉｄｅ［１３］．邋（ａ）邋Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ邋ｈｙｄｒｏｇｅｎ邋ｓｕｌｆｉｄｅ邋（Ｈ２Ｓ）邋ｏｃｃｕｒｓ邋ｄｕｅ逡逑ｔｏ邋ｇｅｏｔｈｅｒｍａｌ邋ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ邋ｓｕｃｈ邋ａｓ邋ｖｏｌｃａｎｏｅｓ

１．２．１胱硫醚個裂解酶ＣＳＥ逡逑ＣＳＥ主要催化ＰＬＰ邋（ｐｙｒｉｄｏｘｙｌ邋５－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，ＰＬＰ）依賴的半骯氨酸和同型半逡逑胱氨酸產(chǎn)生丙酮酸和ａ－酮戊二酸的反應，同時釋放出氨（ＮＨ３）和Ｈ２Ｓ邋（圖１．２）。逡逑ＣＳＥ主要位于細胞的細胞質(zhì)中，多分布于心血管系統(tǒng)中，，并被認為是心臟病的可逡逑能藥物作用靶點，研宄表明調(diào)節(jié)ＣＳＥ的活性對治療動脈粥樣硬化和其他心血管逡逑疾病的動物模型有一定的影響［１４］。最近的研宄表明，ＣＳＥ產(chǎn)生的Ｈ２Ｓ對減輕心逡逑肌缺血－再灌注（Ｉ／Ｒ）損傷和減輕心律失常減少心肌梗死等方面具有許多保護作用逡逑［１５，１６］。除了參與心血管系統(tǒng)的活動外，ＣＳＥ還有助于其他器官的細胞信號的傳逡逑遞和穩(wěn)態(tài)。例如Ｌｅｆｅｒ等發(fā)現(xiàn)，抑制ＣＳＥ可減輕Ｄ－半乳糖胺和脂多糖（ＬＰｓ）引起逡逑的肝損傷［１７］，這一影響是由于細胞內(nèi)硫代硫酸鹽和同型半胱氨酸水平增加，逡逑ＮＦ－Ｅ２邋Ｐ４５因子２（Ｎｒｆ２）和抗氧化蛋白等復雜因素的上調(diào)所導致的。逡逑１．２．２胱硫醚－Ｐ－合成酶ＣＢＳ逡逑ＣＢＳ催化的是ＰＬＰ依賴的反應，其中Ｌ－同型半胱氨酸和Ｌ－絲氨酸反應生成逡逑Ｌ－胱硫醚和Ｈ２Ｏ［１０］。在Ｌ－半胱氨酸存在的條件下
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：Q25

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10 高鋒;何劍斌;張q

本文編號：2621536