【摘要】：宏基因組和單細(xì)胞測序方法不僅可以檢測到環(huán)境中未培養(yǎng)微生物所含有的未知基因,而且可以發(fā)現(xiàn)這些未培養(yǎng)微生物潛在的重要代謝功能和生態(tài)位;但是,這些以基因或基因組為基礎(chǔ)的技術(shù)不能對培養(yǎng)物進(jìn)行全面仔細(xì)的研究,獲得菌株的純培養(yǎng)仍然是非常必要的;為了解決這個問題,目前己開發(fā)出多種未培養(yǎng)細(xì)菌的培養(yǎng)方法,但對細(xì)菌的純培養(yǎng)中仍有許多困難亟待解決,如分離效率的下降,優(yōu)勢菌群對其他物種的影響,細(xì)菌細(xì)胞間信息的交流對生長的影響分離過程中所涉及的高端儀器的使用問題等。本文以實驗室常用的培養(yǎng)基和可培養(yǎng)細(xì)菌為基礎(chǔ),結(jié)合自然界中細(xì)菌個體之間會產(chǎn)生相互作用的現(xiàn)象,設(shè)計了夾心平板技術(shù),并且通過對海洋細(xì)菌的多樣性研究對本方法進(jìn)行了初步的驗證。夾心平板技術(shù)中,夾心培養(yǎng)基共分為上、中、下三層;下層為實驗室常用的2216E培養(yǎng)基,上層為改良的1/10 2216E培養(yǎng)基,中間用可培養(yǎng)細(xì)菌作為夾心菌株;通過對夾心菌株的涂布面積,夾心菌株的處理方式,上層培養(yǎng)基瓊脂的濃度等方面的優(yōu)化,最終確定夾心菌株在下層培養(yǎng)基表面涂布區(qū)域的直徑約為70mm,上層培養(yǎng)基的瓊脂濃度為4%(w/v),并且直接將上層培養(yǎng)基傾倒在夾心菌株表面。采用夾心平板法對威海近海沉積物中的細(xì)菌多樣性進(jìn)行研究,結(jié)果表明:實驗組S25、S63、S69和S70在其夾心菌株的作用下可以使表面細(xì)菌的多樣性增加,而S08、S09、S12、S38和S39組在其夾心菌株的作用下可以使表面細(xì)菌的多樣性降低;在屬水平,各實驗組中優(yōu)勢菌群豐度變化較為明顯的是Psychrobacter、Ruegeria、、Microbulbifer、Aequorivita和Bacillus五個屬;在潛在新物種方面,各組在夾心菌株的作用下均可以增加新菌的比例,尤以S08、S25、S38、S39、S69 和 S70 組最為明顯,并且Flavbbacteriaceaae、Moraxellaceae、Rhldobacteraceae、Halomonadaceae和Phyllobacteriacea 等科的潛在新物種在各組之見差異性較為明顯;通過純培養(yǎng),共得到481株菌,分布于Actinoba和Pria、Bacteroidetes、Firmicutes和Prottobacter 4 4個門中,其中共有149株潛在新物種,新種124株,新屬新種24株,新科新種1株;并且,通過對分離菌株的篩選和驗證,得到17株具有生長依賴現(xiàn)象的菌株。此外,本文對三株新菌進(jìn)行了多相分類。菌株M1309~T分離于威海海參養(yǎng)殖池沉積物,為革蘭氏陰性菌,桿狀且具有滑動性;生長溫度范圍16-42℃,最適生長溫度為37℃;生長pH范圍為6.5-8.0,最適pH為7.0-7.5;生長鹽度范圍為 2.0-6.5%(w/v)NaCl,最適鹽度為 2.0-3.0%(w/v)NaCl;根據(jù) 16S rRNA基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,發(fā)現(xiàn)菌株M1309bT屬于Winogradskgella屬,與其最相似的物種為Winogradskyella porferorum JCM 12885~T,相似度為95.5%;通過對菌株M1309~T的化學(xué)特征分析,發(fā)現(xiàn)其呼吸醌型只有一種為MK-6,主要脂肪酸種類為iso-C_(15:0)、iso-C_(15:1) G和iso-C_(17:0) 3-OH,主要極性脂為PE、兩種AL和三種未知的脂肪酸L;基因組DNA含量為36.1mol%;根據(jù)表型的特異性和系統(tǒng)發(fā)育的差異性,認(rèn)為菌株M1309~T為Wnogradskye為 屬的新物種,并將其命名為Winogradskyella tangerina;模式菌株為 M1309~T(=KCTC 52896~T= MCCC 1K03310~T)。菌株ELS1360-T分離自內(nèi)蒙古湖泊沉積物,為革蘭氏陰性菌、兼性好氧、運動形式為滑動、菌體為桿狀、菌落為粉紅色;在不含NaCl的R2A培養(yǎng)基上,溫度為33℃,pH為6.5-7.0時生長最佳;根據(jù)16S rRNA基因序列,菌株ELS1360~T與菌株Hymenobacter luteus JCM 30328~T和Hymenobacterlatericoloratus JCM 30327~T最為相似,相似度分別為96.9%和96.8%,與Hymenobacter屬的其他成員的相似度均在90.3-96.7%之間;通過發(fā)育樹分析菌株ELS1360~T屬于Hymenobacter屬,并且與菌株Hymenobacterluteus JCM 30328~T和Hymenobacte lericoloratul JCM 30327~T聚在一枝;呼吸醌型為MK-7;主要脂肪酸為iso-C_(15:0),Summed feature 3和C_(16:1)ω5c;主要極性脂為PE、APL和未知的脂肪酸L;基因組DNA的G+C為57.1mol%;通過系統(tǒng)發(fā)育、表型、基因型和化學(xué)分類學(xué)分析,認(rèn)為菌株ELS1360~T是Hymenobacte是屬的一個新物種,并命名為Hymenobacter sediminis;模式菌株為ELS1360~T(=KCTC62449~T=MCCC 1H00319~T)。菌株N24~T分離自西安溫泉水,為革蘭氏陰性菌、具有滑動性、桿狀(寬約0.4-0.8μm,長約1.8-7.8μm);最適生長溫度為33℃,最適生長pH為7.0;可以產(chǎn)生胞外多糖;通過系統(tǒng)發(fā)育樹分析,發(fā)現(xiàn)菌株N24~T在Chitinophagaceae科中形成單獨的一枝,最相似的屬為Flavisobacter、Cnuella、Niveitalea、Flavitalea、Flaviaiaturariibacter和Niatella,16S rRNA基因的相似度為91.7-93.9%;主要脂肪酸種類為iso-C_(15:0)(31.8%)、iso-C_(17:0) 3-OH(16.1%)和iso-C15：1 G(12.9%);極性脂成分為PE、兩種AL和六種未知的脂肪酸L;呼吸醌型為MK-7;基因組DNA的G+C含量為49.3mol%;通過系統(tǒng)發(fā)育、表型、基因型和化學(xué)分類學(xué)分析,認(rèn)為菌株N24~T是Chitinophagaceae科的一個新屬新種,并命名為Paracnuella aquatica;模式菌株為N24~T(=KCTC62083~T=MCCC 1H00301~T)。
【圖文】：

養(yǎng)皿底部鋪一層１．５％瓊脂的固體培養(yǎng)基，之后，傾倒含有潛在助長菌（生長狀逡逑況較好）的０．４％瓊脂軟培養(yǎng)基，鋪上帶有濾膜的聚丙烯環(huán)后，在濾膜上傾倒含逡逑有潛在依賴型菌株（生長狀況較差）的軟瓊脂培養(yǎng)基（如圖１－１所示），培養(yǎng)后逡逑觀察表面菌落的生長狀況［６４］；利用此技術(shù)篩選到了邐ｓｐ．邋ＢＬ１５７和逡逑Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ邋ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ邋ＢＬ１７５，Ｂａｃｔｅｗｉｄｅｓ邋ｆｒａｇｉｌｉｓ邋ＢＬ５３９邋和邋Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ邋ｓｐ．邋ＢＬ２５２逡逑等多組具有助長作用的細(xì)菌。逡逑＿邋．一逡逑圖１邋一１單菌落共培養(yǎng)裝置示意圖逡逑Ｆｉｇ邋１—１邋Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ邋ｄｉａｇｒａｍ邋ｏｆ邋ｓｉｎｇｌｅ邋ｃｏｌｏｎｙ邋ｃｏ－ｃｕｌｔｕｒｅ邋ｄｅｖｉｃｅ逡逑共培養(yǎng)技術(shù)的出現(xiàn)，在一定程度上說明，，易培養(yǎng)的細(xì)菌菌株對難培養(yǎng)或生長逡逑依賴型細(xì)菌的培養(yǎng)具有一定的促進(jìn)作用；但，目前開發(fā)出的共培養(yǎng)技術(shù)及篩選生逡逑長依賴型菌株的方法的應(yīng)用的前提基本是先獲得難培養(yǎng)菌株的純培養(yǎng)物，之后再逡逑用易培養(yǎng)菌株刺激其生長，并不能直接用于從環(huán)境樣品中分離未培養(yǎng)、難培養(yǎng)或逡逑生長依賴型菌株；此外，共培養(yǎng)技術(shù)仍不太成熟，需要進(jìn)一步的開發(fā)。逡逑１．３立題依據(jù)逡逑任何一種細(xì)菌都必須先在體外培養(yǎng)，然后才能全面研究其生理生化特征，才逡逑５逡逑

圖２－１夾心平板表層污染示意圖逡逑ａｔｉｃ邋ｄｉａｇｒａｍ邋ｏｆ邋ｓａｎｄｗｉｃｈ邋ｐｌａｔｅ邋ｓｕｒｆａｃｅ邋ｃｏ下層培養(yǎng)基表面的涂布面積逡逑養(yǎng)基表面的涂布區(qū)域直徑設(shè)置約為４０、，上層１／１０邋２２１６Ｅ培養(yǎng)基冷卻到５０°Ｃ左覆蓋一層玻璃紙或濾紙逡逑后，在表面覆蓋一層玻璃紙或者濾紙片積大，操作時盡量使兩者與培養(yǎng)基表面層培養(yǎng)基從濾紙片或玻璃紙的中心開始察，每組實驗設(shè)置１０個平行，重復(fù)３培養(yǎng)基混合后再傾倒上層培養(yǎng)基逡逑
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：Q93

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本文編號：2618922