【摘要】：5'-核糖核苷酸水解酶簡(jiǎn)稱(chēng)5'-核苷酸酶(5'-NT),5'-NT能夠水解多種核糖核苷-5'-磷酸和脫氧核糖核苷-5'-磷酸,最終生成相應(yīng)的核苷和無(wú)機(jī)磷酸。在生物細(xì)胞中有多種酶參與核苷酸的生物合成和代謝分解,以保證核苷酸和核苷的量處于適當(dāng)水平。核苷酸和核苷的庫(kù)存量保持動(dòng)態(tài)平衡,這有利于實(shí)現(xiàn)DNA和RNA的有效合成。由于5'-NT能夠催化5'-核苷酸產(chǎn)生相應(yīng)的核苷和磷酸從而能夠調(diào)節(jié)體內(nèi)核苷酸和核苷水平,這一機(jī)制在體內(nèi)發(fā)揮著重要作用。與核苷酸酶作用相反的是核苷酸激酶,核苷酸激酶能夠催化核苷與無(wú)機(jī)磷酸生成相應(yīng)的核苷酸。5'-核苷酸酶的分布較為廣泛,例如細(xì)菌、植物細(xì)胞和脊椎動(dòng)物組織等都含有5'-核苷酸酶。根據(jù)5'-核苷酸酶含有的保守結(jié)構(gòu)域分類(lèi),主要分為HAD家族和HD家族,HAD家族的5'-核苷酸酶目前研究較多,HD家族的5'-核苷酸酶在真核生物中尚未有研究。YB92是一種重要的5'-核苷酸酶,它能夠?qū)?'-核苷單磷酸水解為相應(yīng)核苷和磷酸。YB92結(jié)構(gòu)上含有HD結(jié)構(gòu),具有HD結(jié)構(gòu)域的蛋白可具有核苷酸酶和磷酸二酯酶活性,并且它們?cè)谛盘?hào)傳導(dǎo)和核苷酸代謝中起重要作用。我們利用生物化學(xué)方法和結(jié)構(gòu)生物學(xué)方法對(duì)釀酒酵母的HD結(jié)構(gòu)域蛋白YB92(YBR242W)的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行研究。通過(guò)核苷單磷酸與YB92反應(yīng)實(shí)驗(yàn),表明了YB92(YBR242W)是核苷5'-單磷酸水解酶,YB92蛋白的脫氧核糖核苷5'-單磷酸酶的活性超過(guò)核糖核苷5'-單磷酸酶的活性;核苷三磷酸抑制試驗(yàn)表明,核苷三磷酸抑制YB92(YBR242W)水解核苷單磷酸。通過(guò)對(duì)YB92蛋白進(jìn)行大規(guī)模的純化表達(dá),將蛋白進(jìn)行蛋白質(zhì)晶體生長(zhǎng)條件篩選和優(yōu)化,得到了質(zhì)量較高的晶體,用X射線(xiàn)對(duì)晶體進(jìn)行衍射,解析了 YB92-ATP復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)。從結(jié)構(gòu)上看,YB92是由8個(gè)α螺旋和4個(gè)反向平行的β折疊組成。通過(guò)比對(duì)發(fā)現(xiàn)YB92的結(jié)構(gòu)類(lèi)似于來(lái)自大腸桿菌的HD家族的YfbR晶體結(jié)構(gòu),將兩個(gè)結(jié)構(gòu)疊加后,推斷YB92可能和YfbR具有相同的催化底物結(jié)合位點(diǎn)。分子篩柱層析色譜和交聯(lián)實(shí)驗(yàn)研究表明,溶液中的YB92蛋白以二聚體形式存在,這與YB92結(jié)構(gòu)的觀察的結(jié)果和分析結(jié)果一致。我們將HD結(jié)構(gòu)域活性中心附近的一些保守氨基酸進(jìn)行定點(diǎn)突變,發(fā)現(xiàn)與二價(jià)金屬配位氨基酸殘基以及活性位點(diǎn)附近保守殘基對(duì)YB92活性至關(guān)重要。與金屬離子配位Asp79、His80、His108和Asp109殘基,活性位點(diǎn)附近的保守E112和E133點(diǎn)對(duì)催化活性是至關(guān)重要的。此外,從結(jié)構(gòu)上看,YB92的K59穿過(guò)界面進(jìn)入到另一單體靠近活性中心位置,我們推測(cè)K59與相鄰分子中的活性中心部分氨基酸殘基(E75/E181/Q185)有氫鍵相互作用,我們用生化實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了K59影響整個(gè)YB92的催化活性�？傊�,我們結(jié)構(gòu)比對(duì)和突變研究結(jié)果表明YB92在釀酒酵母中起5'-核苷酸酶的作用。
【圖文】：

兩者都是活性中心中一個(gè)天冬氨酸親核發(fā)生攻擊，在附近的另一個(gè)天冬氨酸作為逡逑電子供體，攻擊各種底物的碳原子和磷酸鹽之間的分子鍵＇其具體的作用方式逡逑如圖１．１所示：逡逑ｑ邋ｈａｌｏａＯｉａｎｏａｆｅｄｅｈｔｆｏｇｅｎａｓｅｓ邐＾逡逑Ｃ－Ａ．ｐ＾00＾Ｔｒ＾Ｃ＾邐二ｙ0—＿．Ｅ－Ａ？Ｐ－＜0０＊邐ｌ逡逑ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅｓ邋ａｎｄ邋ＡＴＰａｓｅｓ邐ｒ0ｈ邐＾邐ｆ邋Ｍ邐ＭＯ＾逡逑Ｅ－Ａｓｐ－＜＾邐ＯＲ邐Ｅ邋}0邋＜＜＾－｜一。０—？邋Ｅ－Ａ＊ｐ－＜邋ｑ邋？邋ＦＯ，邐Ａｓｐ邋ｎ邋，邋’邋ｆ＼逡逑0邐０卜邋ＣＨｌ－ＣＨ邋ｉｅ邐°邐／邋／＾Ｒ逡逑ｐｈｏｓｐｈｏｒａｔｅ＊邐ｐ邐ＨａＯ邐Ｃ0邐0……—ｇ２，”。＿邋＼逡逑一Ｅ－一令邋ＰＯ．．．岕１邋Ｖ、。丫0逡逑她邐Ｅ邐０邐Ａｉ＾ｌｕ邐Ａ＾？Ｇｉｕ逡逑Ｊ＞邋0邐＾邐ｊＰ邋Ｏ邐ＭｏＭＡ邐Ｍｏｔｉｆ邋４逡逑一－0ｅ邋—，邐ＣＨｌ0Ｊ＿0ｅ＿＿Ｅ－＊＊＞－＜０＿｜＿0ｅ逡逑．屒Ｗ逡逑圖１．邋１邋ＨＡＤ水解酶家族反應(yīng)機(jī)理逡逑Ｆｉｇ．邋１．１邋Ｔｈｅ邋ｒｅａｃｔｉｏｎ邋ｍｅｃｈａｎｉｓｍ邋ＨＡＤ邋ｈｙｄｒｏｌａｓｅ邋ｆａｍｉｌｙ逡逑通過(guò)解析ＨＡＤ結(jié)構(gòu)域的蛋白結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)ＨＡＤ磷酸酶在核心結(jié)構(gòu)域中具有獨(dú)特逡逑的ＨＡＤ折疊方式，其特征是由重復(fù)ａ邋／ｐ單元組成的三層ａ邐三明治結(jié)構(gòu)ｍ］。逡逑核心結(jié)構(gòu)域中的活性位點(diǎn)具有四個(gè)環(huán)構(gòu)建的基序（基序Ｉ－ＩＶ）�；颍�

兩者都是活性中心中一個(gè)天冬氨酸親核發(fā)生攻擊，在附近的另一個(gè)天冬氨酸作為逡逑電子供體，攻擊各種底物的碳原子和磷酸鹽之間的分子鍵＇其具體的作用方式逡逑如圖１．１所示：逡逑ｑ邋ｈａｌｏａＯｉａｎｏａｆｅｄｅｈｔｆｏｇｅｎａｓｅｓ邐＾逡逑Ｃ－Ａ．ｐ＾00＾Ｔｒ＾Ｃ＾邐二ｙ0—＿．Ｅ－Ａ？Ｐ－＜0０＊邐ｌ逡逑ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅｓ邋ａｎｄ邋ＡＴＰａｓｅｓ邐ｒ0ｈ邐＾邐ｆ邋Ｍ邐ＭＯ＾逡逑Ｅ－Ａｓｐ－＜＾邐ＯＲ邐Ｅ邋}0邋＜＜＾－｜一。０—？邋Ｅ－Ａ＊ｐ－＜邋ｑ邋？邋ＦＯ，邐Ａｓｐ邋ｎ邋，邋’邋ｆ＼逡逑0邐０卜邋ＣＨｌ－ＣＨ邋ｉｅ邐°邐／邋／＾Ｒ逡逑ｐｈｏｓｐｈｏｒａｔｅ＊邐ｐ邐ＨａＯ邐Ｃ0邐0……—ｇ２，”。＿邋＼逡逑一Ｅ－一令邋ＰＯ．．．岕１邋Ｖ、。丫0逡逑她邐Ｅ邐０邐Ａｉ＾ｌｕ邐Ａ＾？Ｇｉｕ逡逑Ｊ＞邋0邐＾邐ｊＰ邋Ｏ邐ＭｏＭＡ邐Ｍｏｔｉｆ邋４逡逑一－0ｅ邋—，邐ＣＨｌ0Ｊ＿0ｅ＿＿Ｅ－＊＊＞－＜０＿｜＿0ｅ逡逑．屒Ｗ逡逑圖１．邋１邋ＨＡＤ水解酶家族反應(yīng)機(jī)理逡逑Ｆｉｇ．邋１．１邋Ｔｈｅ邋ｒｅａｃｔｉｏｎ邋ｍｅｃｈａｎｉｓｍ邋ＨＡＤ邋ｈｙｄｒｏｌａｓｅ邋ｆａｍｉｌｙ逡逑通過(guò)解析ＨＡＤ結(jié)構(gòu)域的蛋白結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)ＨＡＤ磷酸酶在核心結(jié)構(gòu)域中具有獨(dú)特逡逑的ＨＡＤ折疊方式，，其特征是由重復(fù)ａ邋／ｐ單元組成的三層ａ邐三明治結(jié)構(gòu)ｍ］。逡逑核心結(jié)構(gòu)域中的活性位點(diǎn)具有四個(gè)環(huán)構(gòu)建的基序（基序Ｉ－ＩＶ）�；颍�
【學(xué)位授予單位】：安徽大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：Q55

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本文編號(hào)：2618812