發(fā)布時(shí)間：2020-04-03 12:33

【摘要】：仙茅(Curculigo orchioides Gaertn)為石蒜科仙茅屬多年生草本,又名地棕、獨(dú)茅、仙茅參,其根莖入藥,主要用于治療腎陽(yáng)不足、陽(yáng)痿遺精、虛癆內(nèi)傷,筋骨疼痛等病癥。隨著對(duì)仙茅藥用價(jià)值的深入了解,仙茅市場(chǎng)需求逐漸加大,仙茅野生資源受到破壞而大量減少,人工栽培仙茅也因土地資源、農(nóng)藥殘留、季節(jié)影響、活性成分含量差異等因素影響而受到了限制。因此本課題決定采用植物細(xì)胞工程技術(shù)來(lái)生產(chǎn)仙茅苷,可以縮短仙茅資源的利用周期,更有效的保護(hù)仙茅種質(zhì)資源,有利于仙茅產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展與產(chǎn)業(yè)升級(jí)。本文以仙茅為材料,采用幼葉作為外植體誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織,經(jīng)反復(fù)繼代后,以MS+2.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/LNAA為培養(yǎng)基,在溫度為25℃,轉(zhuǎn)速120 r/min,光照12 h/d,光照強(qiáng)度1 200 lx條件下進(jìn)行培養(yǎng)21d,成功建立了懸浮細(xì)胞系。對(duì)懸浮細(xì)胞系在培養(yǎng)過(guò)程中的生物量、pH、PAL酶活性和代謝產(chǎn)物進(jìn)行了相關(guān)研究,結(jié)果表明懸浮細(xì)胞系在一定的培養(yǎng)周期內(nèi)能產(chǎn)生仙茅苷等代謝產(chǎn)物,但含量較低,且與細(xì)胞生物量,PAL酶活性,pH變化呈相關(guān)關(guān)系。通過(guò)響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)研究接種密度、振蕩頻率、碳源濃度、以及生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑2,4-D等因素對(duì)細(xì)胞增殖的影響,結(jié)果表明:各因素促進(jìn)細(xì)胞增殖的最佳響應(yīng)水平為,接種量73.94 g/L、2,4-D0.59mg/L、搖床轉(zhuǎn)速103.75 r/min、碳源濃度40.28g/L,在此條件下經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,所得懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)良好,最大生物量為15.26±0.3×10~5個(gè)/mL。通過(guò)研究不同光照、溫度、pH條件處理對(duì)仙茅細(xì)胞生長(zhǎng)與仙茅苷合成的影響,結(jié)果表明,光照條件為12h/d,1200x,溫度為26℃時(shí),初始pH為5.8～6.2時(shí),有利于仙茅細(xì)胞生長(zhǎng)與仙茅苷的合成。通過(guò)研究不同前體和誘導(dǎo)子條件處理對(duì)仙茅細(xì)胞生長(zhǎng)與仙茅苷合成的影響結(jié)果表明,添加L-苯丙氨酸、茉莉酸甲酯、水楊酸均能促進(jìn)仙茅苷的生物合成。當(dāng)L-苯丙氨酸為100mg/L時(shí),仙茅苷的含量最高為3.32±0.18 mg/g干重,為對(duì)照組的2.48倍。茉莉酸甲酯為100 μmol/L時(shí),仙茅苷含量最高為2.54±0.24 g/L干重,為對(duì)照組1.85倍。水楊酸為50 μmol/L,仙茅苷含量最高為3.088 mg/g干重,為對(duì)照組的2.36倍。通過(guò)研究前體和誘導(dǎo)子處理對(duì)懸浮細(xì)胞培養(yǎng)液PAL酶活、總糖耗量和pH變化的影響,結(jié)果表明,前體L-苯丙氨酸,誘導(dǎo)子茉莉酸甲酯和水楊酸均能加大細(xì)胞的糖耗量,誘導(dǎo)子茉莉酸甲酯和水楊酸可提高懸浮細(xì)胞PAL酶活性與懸浮培養(yǎng)液pH。
【圖文】：

Ｆｉｇｕｒｅ邋２－４邋Ｇｒｏｗｔｈ邋ｃｕｒｖｅ邋ｏｆ邋Ｃｕｒｃｕｌｉｇｏ邋ｃｅｌｌ邋ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ邋ｃｕｌｔｕｒｅ逡逑（２）仙茅懸浮細(xì)胞培養(yǎng)液ｐＨ變化曲線(xiàn)逡逑仙茅懸浮細(xì)胞培養(yǎng)液變化情況見(jiàn)（圖２－５）。由圖可知，在整個(gè)懸浮培養(yǎng)期，逡逑仙茅細(xì)胞懸浮培養(yǎng)液ｐＨ呈動(dòng)態(tài)變化，，其變化區(qū)間為（３．６３？５．８０）。仙茅懸浮逡逑細(xì)胞培養(yǎng)液的ｐＨ在生長(zhǎng)周期中的延滯期（0？７邋ｄ）是急劇下降的，在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)逡逑期（７？１４邋ｄ）逐漸上升，到１６邋ｄ時(shí)達(dá)到最高，恰好處于培養(yǎng)周期中的穩(wěn)定期（１４？逡逑２０邋ｄ），之后培養(yǎng)液ｐＨ又緩慢下降。逡逑６．５邋－Ｉ逡逑６．０邐■邋丁逡逑廣＼逡逑ｒ：邋ＶＪ逡逑３．０邋＾邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ逡逑０邋２邋４邋６邋８邋１０邋１２邋１４邋１６邋１８邋２０邋２２邋２４逡逑Ｄａｔｅｓ逡逑圖２－５仙茅細(xì)胞培養(yǎng)液ｐＨ的變化逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２－５邋ｐＨ邋ｃｈａｎｇｅｓ邋ｉｎ邋Ｃｕｒｃｕｌｉｇｏ邋ｃｅｌｌ邋ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ邋ｃｕｌｔｕｒｅ逡逑２１逡逑

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【學(xué)位授予單位】：中南林業(yè)科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：Q943.1

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2613375