【摘要】：海洋來(lái)源真菌生長(zhǎng)于高吐壓、低營(yíng)養(yǎng)、低溫、含鹽海水環(huán)境中,形成了耐饑、耐鹽、耐堿的獨(dú)特生態(tài)特性和適應(yīng)機(jī)制,產(chǎn)生不同于陸生微生物次生產(chǎn)物代謝產(chǎn)物。海洋來(lái)源真菌因可規(guī)�；囵B(yǎng)引起藥物學(xué)家的關(guān)注。海洋真菌的次生代謝產(chǎn)物類型主要包括生物堿、聚酮、肽類、甾體、萜類、等。多數(shù)化合物表現(xiàn)出抗炎、抗菌、抗病毒和抗腫瘤等生物活性。目前全球抗菌藥物不合理的使用加速了超級(jí)耐藥細(xì)菌的產(chǎn)生,新一代抗生素的開發(fā)迫在眉睫�，F(xiàn)有的抗生素絕大多數(shù)是從土壤源微生物中篩選獲得,為了獲得新型抗生素,海洋來(lái)源的抗生素引起了人們的極大興趣海洋來(lái)源的天然產(chǎn)物較陸地來(lái)源的具有更新穎的結(jié)構(gòu)、更強(qiáng)的活性,為發(fā)現(xiàn)更理想的抗菌先導(dǎo)化合物提供物質(zhì)基礎(chǔ)。本文建立一種快速篩選具有抗菌活性的真菌方法,設(shè)計(jì)并改良了一種雙層瓊脂板快速篩選方法利用改良雙層瓊脂板篩選法,從20株海洋來(lái)源的真菌中快速篩選獲得一株具有顯著抗菌活性的菌株WZXY-33-10,通過(guò)鑒定活性菌株為Fusarium equisetin并通過(guò)現(xiàn)代色譜學(xué)及波譜學(xué)方法從其發(fā)酵物中分離鑒定了 2個(gè)抗菌活性化合物equisetin(1)和epi-equisetin(2)能特異性殺滅多種多重耐藥的革蘭氏陽(yáng)性菌,并對(duì)equisetin合成基因簇進(jìn)行改造,得到equisetin高產(chǎn)菌株。隨著DNA測(cè)序技術(shù)發(fā)展,許多新合成基因簇被發(fā)現(xiàn),在這些微生物的次生代謝相關(guān)基因中,主要包括編碼次級(jí)代謝途徑的基因和調(diào)控基因,根據(jù)基因組序列分析,能夠確定基因編碼的酶所催化的化學(xué)反應(yīng),為我們有目的的進(jìn)行基因改造。本文通過(guò)二代測(cè)序技術(shù)對(duì)這株Fusarium equiseti木賊鐮刀菌進(jìn)行全基因組測(cè)序,獲得該株菌中equisetin生物合成基因簇的詳細(xì)信息;分析各基因或結(jié)構(gòu)域在equisetin合成過(guò)程中的功能,根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,對(duì)合成基區(qū)簇的調(diào)節(jié)因子eqxR進(jìn)行過(guò)表達(dá),通過(guò)PEG/CaC12介導(dǎo)原生質(zhì)體遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù),對(duì)eqxR基因進(jìn)行研究轉(zhuǎn)化,從而獲得突變菌株。
【圖文】：

重組液放于－２０°Ｃ備用或者直接轉(zhuǎn)化ＴｍｎｓＴｌ感受態(tài)逡逑圖３－２閃電克隆連接原理模式圖逡逑（１）使用移液器輕輕吸打混勻，短暫離心將反應(yīng)液收集至管底逡逑（２）單片段重組反應(yīng)，５０°Ｃ邋５ｍｍ：降至４°Ｃ或立即置于冰上冷卻。逡逑３．３．３轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞并挑選單克隆菌落逡逑３．３．３．１制備感受態(tài)細(xì)胞逡逑（１）在ＬＢ固體平板挑取單克隆菌落（Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５ａ），接種于ｌＯｍＬＬＢ液體培養(yǎng)基逡逑中，３７°Ｃ逡逑２２０ｒｐｍ，培養(yǎng)邋１２ｈ。逡逑（２）將菌液１：邋１００接種，如５００ｐＬ菌液加入到５０ｍＬ邋ＬＢ液體培養(yǎng)基中，，３７°Ｃ震逡逑蕩培養(yǎng)３ｈ左右，ＯＤ值為０．４－０．５之間。逡逑（３）把菌液加到５０ｍＬ康寧離心管中，冰上靜置ｌＯｍｉｎ。逡逑（４）邐４０００ｒｐｍ離心ｌＯｍｉｎ，倒掉上清，將離心管倒置２ｍｉｎ，使培養(yǎng)基全部留走。逡逑

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本文編號(hào)：2613247