脂肪酶是重要的工業(yè)酶之一,其來源、種類、結(jié)構(gòu)和催化反應(yīng)多種多樣,因而廣泛地用于食品、醫(yī)藥和新能源開發(fā)等領(lǐng)域。黑曲霉脂肪酶是使用最早的脂肪酶之一。然而,黑曲霉脂肪酶晶體結(jié)構(gòu)未知,對其性質(zhì)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)還不清楚。因此,本文利用黑曲霉GZUF36菌株,逆轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增得到一條黑曲霉GZUF36sn-1,3選擇性胞外脂肪酶（EXANL1）基因,該基因分別在大腸桿菌和畢赤酵母表達(dá),分別對其表達(dá)重組酶分離純化和酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行深入研究,基于同源建模和小角X射線散射對畢赤酵母表達(dá)重組酶進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析,這些為EXANL1進(jìn)一步晶體結(jié)構(gòu)解析和分子改造提供借鑒和指導(dǎo)。主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下:（1）EXANL1在大腸桿菌中的克隆表達(dá)、純化及其酶學(xué)性質(zhì)表征根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫報道的黑曲霉脂肪酶基因序列（GenBank ID:KJ703109.1）,設(shè)計引物,逆轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增得到EXANL1的編碼蛋白序列,全長894 bp。生物信息學(xué)分析EXANL1基因與其他黑曲霉脂肪酶的基因序列相似性在90%以上,編碼297個氨基酸,存在57 bp信號肽序列,預(yù)測蛋白成熟肽（278個氨基酸）與黑曲霉F044,黑曲霉CBE 332.1,黑... 

【文章來源】：貴州大學(xué)貴州省 211工程院校

【文章頁數(shù)】：115 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 緒論
    1.1 脂肪酶概述
        1.1.1 脂肪酶的結(jié)構(gòu)特征
        1.1.2 脂肪酶的催化機(jī)理
        1.1.3 脂肪酶的來源
        1.1.4 黑曲霉脂肪酶
    1.2 蛋白質(zhì)分離純化
    1.3 小角X射線溶液散射在生物大分子結(jié)構(gòu)解析中的應(yīng)用
    1.4 蛋白質(zhì)模擬理論
        1.4.1 同源建模
        1.4.2 分子對接
    1.5 立題背景與主要研究內(nèi)容
        1.5.1 立題背景及意義
        1.5.2 主要研究內(nèi)容
第二章 黑曲霉GZUF36 sn-1,3 胞外脂肪酶EXANL1 在大腸桿菌的表達(dá)、純化及酶學(xué)性質(zhì)表征
    2.1 材料
        2.1.1 主要試劑
        2.1.2 主要儀器
        2.1.3 菌株和質(zhì)粒
        2.1.4 培養(yǎng)基
        2.1.5 相關(guān)溶液的配制
    2.2 方法
        2.2.1 黑曲霉GZUF36 培養(yǎng)及RNA提取樣品前處理
        2.2.2 黑曲霉GZUF36總RNA的提取
        2.2.3 黑曲霉GZUF36 脂肪酶c DNA的 RT-PCR
        2.2.4 PCR產(chǎn)物純化和回收
        2.2.5 瓊脂糖凝膠核酸電泳
        2.2.6 黑曲霉GZUF36 脂肪酶EXANL1的c DNA基因測序
        2.2.7 黑曲霉GZUF36 脂肪酶EXANL1 的生物信息學(xué)分析
        2.2.8 EXANL1的大腸桿菌工程菌構(gòu)建
        2.2.9 重組EXANL1的可溶性誘導(dǎo)表達(dá)
        2.2.10 重組EXANL1的純化
        2.2.11 SDS-PAGE分析蛋白純度
        2.2.12 蛋白濃度的測定
        2.2.13 EXANL1脂肪酶活力的測定
        2.2.14 重組EXANL1最適溫度和溫度穩(wěn)定性的測定
        2.2.15 重組EXANL1 最適p H和 p H穩(wěn)定性的測定
        2.2.16 位置選擇性分析
    2.3 結(jié)果與討論
        2.3.1 RT-PCR克隆EXANL1
        2.3.2 EXANL1的生物信息學(xué)分析
        2.3.3 Sn-1,3胞外脂肪酶在大腸桿菌中的表達(dá)和純化
        2.3.4 重組黑曲霉GZUF36胞外脂肪酶的最適溫度和溫度穩(wěn)定性
        2.3.5 重組黑曲霉GZUF36 胞外脂肪酶的最適p H和 p H穩(wěn)定性
        2.3.6 重組酶位置特異性分析
        2.3.7 重組黑曲霉GZUF36胞外脂肪酶與黑曲霉F044脂肪酶性質(zhì)差異分析
    2.4 本章小結(jié)
第三章 EXANL1的高活性表達(dá)及其酶學(xué)性質(zhì)研究
    3.1 材料和方法
        3.1.1 試驗材料
        3.1.2 儀器與設(shè)備
        3.1.3 構(gòu)建重組菌株
        3.1.4 EXANL1的誘導(dǎo)表達(dá)
        3.1.5 重組EXANL1的純化
        3.1.6 糖基化分析
        3.1.7 重組EXANL1的酶學(xué)性質(zhì)
        3.1.8 蛋白含量的測定
        3.1.9 脂肪酶酶活分析
        3.1.10 數(shù)據(jù)分析
    3.2 結(jié)果與討論
        3.2.1 構(gòu)建重組菌株
        3.2.2 重組EXANL1的表達(dá)與純化
        3.2.3 糖基化分析
        3.2.4 重組EXANL1的生化表征
    3.3 本章小結(jié)
第四章 基于同源建模和小角X射線散射對黑曲霉GZUF36胞外脂肪酶的結(jié)構(gòu)表征
    4.1 材料與方法
        4.1.1 序列搜索
        4.1.2 二級結(jié)構(gòu)分析
        4.1.3 同源建模
        4.1.4 模型精煉和質(zhì)量評估
        4.1.5 p EXANL1 的分子對接研究
        4.1.6 p EXANL1 的純化,樣品制備和SAXS分析
    4.2 結(jié)果與討論
        4.2.1 序列比對
        4.2.2 二級結(jié)構(gòu)分析
        4.2.3 p EXANL1 同源建模和模型評價
        4.2.4 p EXANL1 的結(jié)構(gòu)分析
        4.2.5 p EXANL1 的分子對接研究
        4.2.6 p EXANL1 蛋白純度分析
        4.2.7 SAXS分析p EXANL1 的低分辨結(jié)構(gòu)
    4.3 本章小結(jié)
第五章 結(jié)論與展望
    5.1 主要結(jié)論
    5.2 展望
    5.3 本論文的創(chuàng)新點
致謝
參考文獻(xiàn)
附錄
圖版


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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博士論文
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本文編號：3061247