谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶(TGase)已廣泛應(yīng)用于肉制品加工中,催化肌肉蛋白中谷氨酰胺(Gln)與賴氨酸(Lys)殘基發(fā)生�；D(zhuǎn)移反應(yīng),形成高粘性的蛋白凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),改善肉制品的品質(zhì)。其交聯(lián)效果與底物蛋白結(jié)構(gòu)密切相關(guān),然而肌肉蛋白的結(jié)構(gòu)會(huì)因貯藏、運(yùn)輸和加工中的蛋白氧化及肉制品中磷酸鹽的添加而發(fā)生改變,可能改變TGase可利用的Gln和Lys殘基含量,故可能影響TGase交聯(lián)模式。本實(shí)驗(yàn)以豬外脊肉提取的肌球蛋白和肌原纖維蛋白為研究對象,以Fenton羥自由基氧化系統(tǒng)(FeC1_3/L-抗壞血酸/H_2O_2,pH 6.25)為模型,進(jìn)行TGase交聯(lián)(E:S=1:20),研究焦磷酸鹽引起的豬肉肌球蛋白結(jié)構(gòu)變化對TGase交聯(lián)反應(yīng)的影響,主要研究內(nèi)容及結(jié)果如下:研究焦磷酸鈉(TSPP)引起豬肉肌球蛋白結(jié)構(gòu)變化對TGase交聯(lián)程度的影響發(fā)現(xiàn):對于未經(jīng)TSPP處理( TSPP)肌球蛋白,隨著H_2O_2濃度(1~50 mmol/L)增加,頭部的兩個(gè)活性巰基SH1和SH2被封閉程度顯著增加(P0.05),表面疏水性呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢,α-螺旋結(jié)構(gòu)的含量由48.74%降至44.51%。TSPP處理(+TSPP)在一定程度上減弱SH1和SH2的氧化修飾程度,顯著降低肌球蛋白的表面疏水性(P0.05),α-螺旋結(jié)構(gòu)的含量增加至49.83%,說明TSPP在氧化過程中能更好的保護(hù)肌球蛋白的二級結(jié)構(gòu)。TGase交聯(lián)會(huì)導(dǎo)致α-螺旋結(jié)構(gòu)顯著減少(P0.05),表面疏水性顯著增加(P0.05),且變化程度在經(jīng)TSPP處理后進(jìn)一步加深。TGase交聯(lián)引起的α-螺旋結(jié)構(gòu)的相對變化量與氧化程度有關(guān):對于 TSPP樣品,輕度氧化(1 mmol/L H_2O_2)未氧化重度氧化(30和50 mmol/L H_2O_2);對于+TSPP樣品,隨著H_2O_2濃度增加而逐漸增加。自由氨基和SDS-PAGE結(jié)果顯示,TSPP能夠促進(jìn)TGase催化下的交聯(lián)程度。研究TSPP引起的肌球蛋白結(jié)構(gòu)變化對TGase交聯(lián)的活性底物Gln殘基的影響發(fā)現(xiàn):對于 TSPP樣品,未氧化時(shí)TGase交聯(lián)的活性底物Gln殘基位于S1(Gln-613)和LMM(Gln-1498),而重度氧化時(shí)(50 mmol/L H_2O_2),S1(Gln-613)不再是TGase交聯(lián)的活性位點(diǎn);對于+TSPP樣品,未氧化時(shí)TGase交聯(lián)的活性底物Gln殘基位于S1(Gln-558和Gln-613)、S2(Gln-1361和Gln-1373)、LMM(Gln-1422/Gln-1425和Gln-1498),而重度氧化時(shí)Gln-1361不再是TGase交聯(lián)的活性位點(diǎn)。研究TSPP對氧化豬肉肌原纖維蛋白的TGase交聯(lián)程度及凝膠性能的影響發(fā)現(xiàn):無論是否添加TSPP,隨著H_2O_2濃度的升高,肌原纖維蛋白凝膠的儲(chǔ)能模量(G')和凝膠強(qiáng)度均逐漸降低,加入TGase后均有所回升,且增幅隨著H_2O_2濃度升高逐漸降低。相對于 TSPP樣品,+TSPP條件下未氧化樣品的G'和凝膠強(qiáng)度增幅更高,分別達(dá)到72.19%和63.11%,但氧化時(shí)增幅降低速度更快。這說明,雖然TSPP處理有利于TGase交聯(lián)引起的凝膠性能提高,但當(dāng)受到氧化脅迫時(shí),TSPP處理反而對其不利。分析TGase交聯(lián)程度、蛋白結(jié)構(gòu)與凝膠性能之間的相關(guān)性發(fā)現(xiàn):對于 TSPP樣品,氧化和TGase引起的交聯(lián)程度和凝膠性能變化與氨基酸修飾和二級結(jié)構(gòu)顯著相關(guān)(P0.05),而對于+TSPP樣品,這些變化不再與二級結(jié)構(gòu)變化相關(guān)�？梢�,在TSPP條件下,TGase交聯(lián)程度和蛋白凝膠性能與二級結(jié)構(gòu)的相關(guān)性被弱化。綜上所述,本課題闡明了TSPP引起的豬肉肌球蛋白結(jié)構(gòu)變化對TGase交聯(lián)程度及交聯(lián)后蛋白凝膠性能的影響,揭示了影響TGase交聯(lián)和產(chǎn)品品質(zhì)的結(jié)構(gòu)因素,為TGase及其他交聯(lián)酶類在肉制品中的應(yīng)用及產(chǎn)品品質(zhì)控制提供了理論依據(jù)。
【學(xué)位單位】：沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：TS251.1
【部分圖文】：

間的相互作用構(gòu)成了肌肉的運(yùn)動(dòng)。1.2.2 肌球蛋白圖1-1 骨骼肌肉中肌球蛋白分子示意圖Fig. 1-1 Schematic diagram of myosin in skeletal muscle肌球蛋白分子量約為500 KDa，在肌原纖維蛋白中占43%，它由兩條肌球蛋白重鏈（MHC）和四條肌球蛋白輕鏈（LC）組成。每條MHC在胰凝乳蛋白酶的作用下可以水解為重酶解肌球蛋白（HMM）、輕酶解肌球蛋白（LMM）、亞片段1（S1）和桿部Rod。HMM在木瓜蛋白酶的作用下進(jìn)一步水解為S1和亞片段2（S2），結(jié)構(gòu)如圖1-1所示（Xiong，1997）。通過SDS-PAGE電泳分析得知，MHC分子量為205 KDa，三條LC分子量分別為：16 KDa、18 KDa和22 KDa，HMM分子量為140 KDa

12兩個(gè)蛋白質(zhì)片段和一個(gè)α-氨基丁酸（Uchida et al，1990）。圖1-2 蛋白氧化的常見結(jié)果Fig. 1-2 The most common consequences of oxidation of proteins半胱氨酸和甲硫氨酸由于含有硫原子，易受羥自由基攻擊轉(zhuǎn)化為二硫化合物或硫代過氧自由基（Schoneich and Christian，2008），造成蛋白質(zhì)的交聯(lián)。Houghten和L（i1979）、Dean等（1997）指出，這些物質(zhì)是不穩(wěn)定的，可通過還原劑（β-巰基乙醇或二硫蘇糖醇）還原為半胱氨酸或甲硫氨酸。而其他氨基酸需要更嚴(yán)格的條件才能被氧化修飾（Zhang etal，2013）。李銀等（2013a）也證實(shí)了這一說法，肌原纖維蛋白中半胱氨酸、甲硫氨酸及酪氨酸對·OH的敏感程度顯著大于天冬氨酸、甘氨酸及亮氨酸。羰基化合物的是氨基酸側(cè)鏈氧化修飾的最常見產(chǎn)物，通常用來衡量蛋白的氧化程度。羰基通常由以下四個(gè)途徑生成：（a）通過α-酰胺化途徑和β-部位的骨架斷裂；（b）蛋白質(zhì)氨基酸側(cè)鏈

焦磷酸鹽引起肌球蛋白結(jié)構(gòu)變化對 TGase 交聯(lián)程度S-PAGE 電泳進(jìn)行分析。2 mg/mL 的蛋白液與含合，煮沸 3 min，每孔進(jìn)樣 15 μL。然后凝膠.8%冰乙酸的溶液染色 40 min，隨之用含 5%甲凝膠用 GE 的 AI600 超靈敏多功能成像儀成像均為 3 次重復(fù)的平均值。數(shù)據(jù)處理使用 StatisSD 法），不同顯著性數(shù)據(jù)用不同字母標(biāo)記。球蛋白氧化程度的影響

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2830943