核技術(shù)廣泛運用在工業(yè)、科研和醫(yī)療等方面,在促進社會經(jīng)濟發(fā)展的同時對人類的健康也造成了危害。目前,大多數(shù)輻射防護劑具有一定的毒副作用,人類不得不尋找既安全又能抗輻射的藥物。我們前期開展了方格星蟲多糖(Sipunculus nudus polysaccharide,SNP)抗輻射的動物藥效學實驗,結(jié)果發(fā)現(xiàn)SNP對電離輻射誘導的小鼠造血和免疫系統(tǒng)等損傷均具有保護作用。為探索SNP的防護作用機制,本實驗在以往的基礎上,在體外細胞水平開展了研究。具體研究內(nèi)容和獲得的結(jié)果如下:1.SNP的提取與制備:從廣西北海購買曬干的方格星蟲,切段、搗碎,以10%的NaOH堿解,用三氯乙酸脫蛋白,獲得粗多糖;用0.1 mg/mL的葡萄糖做標準溶液,于紫外分光光度計490nm的波長處測定吸光度值,繪制標準曲線,于相同波長條件下測定1 mg/mL方格星蟲粗多糖的吸光度值,經(jīng)計算SNP的多糖含量為60%。2.HUVEC和HIEC細胞輻射損傷模型的建立:選取正常人臍靜脈內(nèi)皮細胞和人腸上皮細胞作為~(137)Csγ射線電離輻射損傷效應模型,HUVEC細胞給予0-10 Gy照射,HIEC細胞給予0-20 Gy照射,照射后采用CCK-8法檢測細胞存活率;2 Gy、4 Gy、6 Gy、8 Gy和10 Gy照射后,HUVEC細胞存活率顯著下降,分別為87.94%、84.69%、70.25%、65.74%和54.78%;經(jīng)2 Gy、4 Gy、6 Gy、8 Gy、10 Gy、15 Gy、20 Gy照射后,HIEC存活率分別為80.39%、76.23%、70.55%、70.82%、66.49%、54.66%和53.12%,與正常對照組相比,差異具有統(tǒng)計學意義(p0.05,p0.01);且細胞存活率均與輻照劑量呈負相關。根據(jù)實驗結(jié)果,結(jié)合相關文獻報道,分別選擇8 Gy和10 Gy作為HUVEC和HIEC細胞輻射損傷的造模劑量。3.SNP對HUVEC和HIEC輻射防護作用的研究:(1)SNP對細胞的毒性實驗結(jié)果表明,與DMSO陽性對照組相比,SNP在實驗濃度范圍內(nèi)(HUVEC細胞SNP終濃度分別為0.5,1,5,10,50,100,200,500?g/mL,HIEC細胞SNP終濃度分別為1、10、50、100、200、500、1 000μg/mL),對細胞無毒性作用;(2)分別以8 Gy和10 Gy ~(137)Csγ射線對HUVEC和HIEC細胞進行一次性照射,研究不同濃度的SNP對受照細胞增殖的影響情況,結(jié)果顯示,一定濃度的SNP預處理能改善照射對細胞增殖的抑制作用;(3)采用Giemsa染色觀察細胞的克隆形成率,結(jié)果顯示,與輻照模型組相比,SNP預處理可有效改善照射后細胞的克隆形成能力;(4)采用Hoechst33342/PI雙染法結(jié)合顯微鏡下觀察細胞凋亡時發(fā)現(xiàn),HUVEC和HIEC細胞的模型組凋亡細胞均較正常對照組增多,SNP預處理后,凋亡細胞均較輻照模型組減少;采用Annexin V/PI染色流式細胞儀定量檢測細胞凋亡率時發(fā)現(xiàn),8 Gy照射HUVEC細胞后,其凋亡率顯著上升(由1.02%上升至15.6%),而SNP預處理組的輻照細胞凋亡率顯著下降至6.8%(P0.01),HIEC經(jīng)10 Gy照射后細胞凋亡率顯著上升(由2.12%上升至14.37%),而經(jīng)SNP預處理后的輻照細胞凋亡率顯著下降至7.18%(p0.01);(5)采用DCFH-DA探針法結(jié)合流式細胞術(shù),檢測HUVEC和HIEC細胞各組樣品中ROS生成水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn),照射后HUVEC細胞中ROS mean值由32.63?10~4增加到47.10?10~4(p0.01),經(jīng)SNP預處理后,細胞內(nèi)ROS mean值降至41.77?10~4(p0.05);HIEC細胞經(jīng)照射后,其ROS mean值由4.76?10~4增加到16.69?10~4,(p0.01),SNP預處理后,細胞內(nèi)ROS mean值降至9.81?10~4(p0.01)。(6)采用試劑盒檢測HUVEC和HIEC細胞各組樣品中抗氧化酶(SOD、CAT、GST、GSH-Px)活性、脂質(zhì)過氧化物(MDA)和DNA氧化損傷產(chǎn)物—8-羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)含量,結(jié)果發(fā)現(xiàn),與正常對照組相比,輻照模型組SOD、CAT、GST、GSH-Px活性降低,MDA和8-OHdG含量升高,SNP預處理后細胞中SOD、CAT、GST、GSH-Px活性較輻照模型組增加,MDA和8-OHdG含量較之下降。4.SNP對HUVEC和HIEC輻射防護作用機理的研究:采用流式細胞術(shù)對HUVEC和HIEC細胞中DNA雙鏈斷裂的標志物γ-H2AX進行檢測,發(fā)現(xiàn)細胞照射后2、4、8 h,輻照模型組中γ-H2AX均升高,SNP預處理的細胞中γ-H2AX均較輻照模型組低(p0.05,p0.01);采用RT-PCR檢測hOGG1和RAD51基因表達時發(fā)現(xiàn),輻照模型組中hOGG1和RAD51的mRNA表達均下調(diào),SNP預處理則顯著上調(diào)了hOGG1和RAD51的表達。綜上,SNP預處理可促進受照細胞增殖和克隆形成,抑制細胞凋亡,能保護抗氧化酶活性,降低MDA和8-OHdG含量含量,減少DNA雙鏈斷裂,上調(diào)hOGG1和RAD51的表達。結(jié)果提示,SNP具有良好的抗輻射作用,其主要作用機制是通過清除自由基、減輕輻射對細胞DNA的氧化損傷、促進DNA修復、減少細胞凋亡,發(fā)揮輻射保護作用。
【學位單位】：上海海洋大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：TS201.4
【部分圖文】：

繼原條件培養(yǎng) 48 小時。PBS 洗 3 次，在冰上消化收集細胞，用 Annexin V/P進行染色，上流式定量檢測各細胞凋亡率，實驗重復 3 次。結(jié)果如圖 4-8 和 4所示，在經(jīng)過 8 Gy137Cs γ 線輻射后，對照組的凋亡率為 15.6%，而 SNP 預處理組的凋亡率為 6.8%，SNP 組凋亡率的顯著降低（P<0.01）。采用 Hoechst33342/PI 法結(jié)合顯微鏡觀察 SNP預處理對輻照后HIEC 細胞凋亡的影響，結(jié)果見圖 4-9。由圖 4-9 可知，輻照后 48 h HIEC 細胞藍色熒光增強，此外，一些細胞內(nèi)出現(xiàn)亮紅色，另外一些細胞內(nèi)出現(xiàn)暗紅色，說明137Cs γ 射線照射至輻射劑量為 10 Gy 后的細胞有凋亡也有壞死，而經(jīng)過 SNP 預處理后，細胞內(nèi)藍色熒光和紅色熒光均降低，提示 SNP 能有效改善輻照對細胞的損傷。為進一步驗證 SNP 的防護效應，我們采用流式細胞儀定量檢測其凋亡率。于輻照后 48 h，冰上消化、離心收集細胞，進行 Annexin V/PI 染色，上流式儀，見圖4-11，圖中右下象限代表細胞早期凋亡的比率，右上象限分別表示晚期凋亡的比率。由圖 4-12 可知，137Cs γ 線輻照后，細胞凋亡率顯著上升（由 2.12% 上升至14.37%），并且以早期凋亡細胞為主，而經(jīng) SNP 預處理后的輻照細胞凋亡率顯著下降，僅為 7.18%，差別有統(tǒng)計學意義（p<0.01），見圖 4-12。0Gy SNP(-)8Gy SNP(-)0Gy SNP(+)8Gy SNP(+)

圖 4-8 流式細胞檢測圖Fig.4-8 Cell apoptosis analysis by flow cytometry圖 4-9 SNP 對 HUVEC 細胞凋亡的影響(** p<0.01,與 0 Gy0 μg/mL SNP 組相比；## p<0.01 與 8 Gy 0 μg/mLSNP 組相比.)Fig.4-9 Effects of SNP on apoptosis of HUVEC cells051015200 8Apoptosisrate(%)Irradiation dose (Gy)SNP（-）SNP（+）**##

圖 4-10 SNP 對輻照后 HIEC 細胞凋亡的影響圖 4-10 SNP 對輻 HIEC 細胞凋亡的影響(Hoechst33342/PI 法)Fig.4-10 Effect of SNP on apoptosis of HIEC cells after irradiation (Hoechst33342/PImethod)0Gy 10GySNP(-)PI-A

【參考文獻】

相關期刊論文 前10條

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本文編號：2815550