發(fā)布時(shí)間：2020-07-11 10:40

【摘要】：雞軟骨富含膠原蛋白和硫酸軟骨素,具有良好的骨健康保護(hù)功效。本文以雞肉加工副產(chǎn)物雞軟骨為原料,采用不同的酶解工藝制備雞軟骨酶解物;通過(guò)特性分析和活性評(píng)價(jià),選用最優(yōu)雞軟骨酶解物進(jìn)行分離純化和結(jié)構(gòu)解析,獲得有明確氨基酸序列的小肽;考察雞軟骨活性肽對(duì)MC3T3-E1增殖、分化和凋亡的影響,并研究其逆轉(zhuǎn)MC3T3-E1細(xì)胞凋亡損傷的作用機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)采用單因素優(yōu)化實(shí)驗(yàn)考察不同蛋白酶、酶底比、pH、溫度和時(shí)間對(duì)雞軟骨粉末酶解的影響。結(jié)果表明,采用0.50%堿性蛋白酶、pH7.0、55°C和9 h進(jìn)行酶解可獲得最優(yōu)雞軟骨酶解物,其蛋白質(zhì)回收率為57.00%,水解度為26.53%,小分子肽(1kDa)占比為61.62%,DPPH·清除IC50值為5.14 mg/mL,ORAC值為0.57μmol TE/mg peptides。皮爾遜相關(guān)性分析結(jié)果表明,酶解物的水解度和分子量分布(1 kDa)分別與其ORAC活性具有顯著的相關(guān)性,相關(guān)系數(shù)r分別為0.737和0.534。采用DEAE-52陰離子交換色譜法和凝膠排阻色譜法對(duì)最優(yōu)雞軟骨酶解物進(jìn)行分離純化,最終獲得具有最高ORAC活性的F1-c組分(3.23μmol TE/mg peptides)。通過(guò)UPLC-ESI-MS/MS法分析,首次鑒定得到五條雞軟骨多肽:GGAP、QIGPA、QLGPA、MPKYA和QGPAN。采用MTT法和EdU法檢測(cè)各多肽對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞增殖的影響,結(jié)果表明0.1 mM的多肽QIGPA、QLGPA、MPKYA和QGPAN孵育細(xì)胞48 h后,細(xì)胞存活率分別提高39.34%、21.44%、21.23%和37.06%。其中,QIGPA多肽能夠顯著促進(jìn)細(xì)胞DNA的合成(p0.05),EdU陽(yáng)性細(xì)胞的占比高達(dá)16.89%。MC3T3-E1細(xì)胞的分化程度隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而提高,雞軟骨多肽(0.1 mM)與分化培養(yǎng)基共同作用3d對(duì)該細(xì)胞堿性磷酸酶活性無(wú)顯著影響(p0.05)。相反,多肽作用7d均能顯著提高細(xì)胞的堿性磷酸酶水平,且當(dāng)分化時(shí)間延長(zhǎng)至14d時(shí),多肽QIGPA、MPKYA和QGPAN共同處理下細(xì)胞中NBT-甲瓚的平均光密度值均顯著高于分化對(duì)照組(p0.05),且均高于0.61。其中,多肽QIGPA與QGPAN的堿性磷酸酶活性分別高達(dá)為200.03和276.56 nmol/min/mg protein。結(jié)果表明,雞軟骨多肽QIGPA、MPKYA和QGPAN具有促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞分化的能力。采用3.2μM的Cd(Ac)_2孵育MC3T3-E1細(xì)胞48 h構(gòu)建鎘誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞凋亡模型,并評(píng)價(jià)雞軟骨多肽(0.5 mM)的保護(hù)作用。CCK-8結(jié)果表明,多肽GGAP、QIGPA、QLGPA和QGPAN作用后細(xì)胞活率較模型組分別提高21.03%、38.54%、42.71%和13.69%。Annexin V-FITC/PI法實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示這四條多肽處理后早期凋亡細(xì)胞占比分別為13.96%、25.48%、13.04%和8.20%,而對(duì)應(yīng)的晚期凋亡和壞死細(xì)胞分別占14.01%、8.40%、3.16%和12.04%,能夠顯著逆轉(zhuǎn)成骨細(xì)胞凋亡損傷(p0.05)。其中,多肽QIGPA和QGPAN作用后其JC-1紅綠平均熒光強(qiáng)度的比值較模型組分別增加15.71%和25.95%,揭示其能夠顯著逆轉(zhuǎn)成骨細(xì)胞凋亡損傷模型的線粒體膜電位的下降(p0.05)。除MPKYA多肽,其余四條雞軟骨多肽均能夠通過(guò)抑制鎘誘導(dǎo)的p-38與ERK1/2蛋白的磷酸化,從而降低成骨細(xì)胞的凋亡損傷。綜上所述,從雞軟骨鑒定所得的QIGPA、MPKYA和QGPAN多肽能促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖和分化;而多肽GGAP、QIGPA、QLGPA和QGPAN能夠逆轉(zhuǎn)成骨細(xì)胞凋亡損傷。上述結(jié)果揭示雞軟骨多肽能通過(guò)促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖分化和減緩成骨細(xì)胞凋亡損傷來(lái)而被選作潛在的骨健康保護(hù)活性成分。同時(shí),這些多肽可作為骨健康相關(guān)功能性食品及特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品開(kāi)發(fā)的原料,在保護(hù)骨健康方面具有廣闊的應(yīng)用前景。
【學(xué)位授予單位】：華南理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：TS251.9
【圖文】：

研究指出，關(guān)節(jié)炎患者骨量的下降不僅出現(xiàn)在軟骨下骨中，患者的其余骨骼的骨量也出現(xiàn)下降[9]。而成骨細(xì)胞與機(jī)體骨細(xì)胞的生成相關(guān)，這表明，關(guān)節(jié)炎的發(fā)生會(huì)導(dǎo)致成骨細(xì)胞功能失調(diào)。在骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生進(jìn)程中，骨細(xì)胞在體外培養(yǎng)過(guò)程中可通過(guò)細(xì)胞間的信號(hào)傳導(dǎo)促進(jìn)軟骨細(xì)胞代謝[10]。1.1.2.2 骨質(zhì)疏松癥研究進(jìn)展骨質(zhì)疏松（Ostroporosis）是一種進(jìn)行性的骨退化疾病，通常伴隨年齡的增長(zhǎng)而發(fā)生[11]。它是以低骨量、骨組織退化和骨微結(jié)構(gòu)破壞為特征的疾病，通�？蓪�(dǎo)致骨折風(fēng)險(xiǎn)的增加[12]。其病理特征如圖 1-1 所示，當(dāng)骨質(zhì)疏松發(fā)生時(shí)，骨質(zhì)疏松組的橈骨（C）和脛骨（D）相比空白對(duì)照組（A 和 B）骨皮質(zhì)變薄，骨小梁質(zhì)量減少，骨小梁連接缺失，骨髓腔變大。

關(guān)細(xì)胞因子進(jìn)行。如圖 1-2 為股骨的骨折修復(fù)過(guò)程[25]，可見(jiàn)骨折愈合過(guò)程包括合成和分解代謝兩個(gè)階段。最初合成代謝階段，組織體積增加并募集血管和骨骼組織干進(jìn)行分化。在臨近骨折線形成軟骨性愈傷組織，這個(gè)軟骨組織周?chē)墓悄づ蛎浶纬晒�。隨著軟骨細(xì)胞分化，其細(xì)胞外基質(zhì)發(fā)生礦化，骨折修復(fù)的合成代謝階段終止，軟骨細(xì)胞凋亡。合成代謝后是分解代謝占主導(dǎo)地位的延長(zhǎng)階段，此階段愈傷組織體小。此階段若軟骨再吸收會(huì)發(fā)生特定合成代謝階段，形成次生骨。當(dāng)新生骨取代軟，初級(jí)血管繼續(xù)生成。隨后，骨重塑開(kāi)始，在原始骨形成第一個(gè)礦化基質(zhì)被破骨細(xì)吸收，同時(shí)軟骨再吸收其沉積的第二個(gè)骨也被吸收。這一延長(zhǎng)期是成骨細(xì)胞和破骨活性的耦合周期，其中骨痂組織被重塑為骨的原始皮質(zhì)結(jié)構(gòu)（耦合重塑）。至此，空間重新建立。在分解代謝的最后階段，發(fā)生了血管重構(gòu)，使得血流速度恢復(fù)到損水平。可見(jiàn)，骨折損傷的愈合需要至少一個(gè)月的漫長(zhǎng)周期，期間成骨細(xì)胞也參與了的愈合。

活性氧和抗氧化劑對(duì)骨重塑中破骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞活性的影響-3 Effect of ROS and antioxidants on the activity of osteoclasts, osteoblasts osteocytes in bone remodeling骨健康功能的物質(zhì)及其研究現(xiàn)狀生素及金屬元素充是骨健康保護(hù)的一個(gè)重要途徑，而來(lái)源于膳食的綠葉蔬菜、水果、給是機(jī)體維生素和金屬離子的來(lái)源之一。已發(fā)現(xiàn)的對(duì)骨健康具有保護(hù)作用的維生素包括 VD、VB12和 VK。V素，對(duì)骨骼健康和礦物質(zhì)代謝至關(guān)重要。它能夠直接作用于成骨細(xì)胞響骨的形成、骨的吸收和骨量，并與非骨組織進(jìn)行相互作用以維持骨[25]。在生理濃度下，活性 VD 通過(guò) RANKL/OPG 信號(hào)通路維持

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2750291