【摘要】：本論文研究內(nèi)容隸屬吉林省科技廳十三五項(xiàng)目(JJKH201800 90KJ)。吡喃花青素是近二十多年來從陳年葡萄酒濾液中檢測到的一種新型花青素衍生物,因其具有高穩(wěn)定性而受到廣泛關(guān)注,在食品、保健品中具有良好的應(yīng)用前景。本文以長白山野生藍(lán)莓為原料,提取制備了藍(lán)莓花青素以及花青素苷元,將花青素苷元與丙酮反應(yīng)合成了吡喃花青素苷元,并通過HPLC和HPLC-MS法對其成分和結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析鑒定。然后對吡喃花青素苷元的穩(wěn)定性、抗氧化活性和對腫瘤細(xì)胞的抑制作用進(jìn)行了比較分析,以人宮頸癌HeLa細(xì)胞株為體外細(xì)胞模型,探究了其對HeLa細(xì)胞的活性、形態(tài)、細(xì)胞周期分布、凋亡的影響,并分別用花青素苷元和藍(lán)莓花青素作為對照樣品進(jìn)行了分析評價(jià),最后利用Western blot技術(shù)對于HeLa細(xì)胞內(nèi)相關(guān)蛋白表達(dá)水平變化進(jìn)行了分析。主要研究如下:1、采用組合柱層析法從藍(lán)莓果實(shí)中提取花青素和花青素苷元,再通過親核加成反應(yīng),由花青素苷元與丙酮反應(yīng)合成了吡喃花青素苷元,并優(yōu)化合成方法,得到吡喃花青素苷元合成的最佳方法為:先將花青素苷元粉末以3.0mg/mL的濃度溶解在60%的乙醇水溶液中,再與3倍體積比的丙酮混合,用HCl溶液調(diào)整體系pH為3.0,在42℃的水域環(huán)境中避光反應(yīng)15d。提取產(chǎn)物通過逐級分離純化后用高效液相色譜對其進(jìn)行定量分析,其中,藍(lán)莓花青素、花青素苷元、吡喃花青素苷元的提取物純度依次分別為63.5%、71.8%和70.2%。2、通過半制備高效液相色譜法對吡喃花青素苷元進(jìn)行了提純后,采用高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用法對其組成和結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析和鑒定,利用質(zhì)譜掃描碎片離子的質(zhì)荷比,鑒定出了吡喃花青素苷元提取物中的5種組分,依出峰順序分別為:甲基吡喃飛燕草素、甲基吡喃矢車菊素、甲基吡喃矮牽牛色素、甲基吡喃芍藥色素與甲基吡喃錦葵色素。這正與花青素苷元提取物中的5組色素依次對應(yīng),并且與高效液相色譜法分析的結(jié)果相一致。3、對吡喃花青素苷元在不同pH、溫度、加熱時(shí)間和金屬離子作用下穩(wěn)定性以及對DPPH、ABTS~+自由基清除能力進(jìn)行了研究。(1)pH穩(wěn)定性研究結(jié)果表明:當(dāng)溶液pH大于3.0時(shí),花青素和花青素苷元的穩(wěn)定性顯著下降,而吡喃花青素苷元在3.0~9.0的酸堿度范圍內(nèi),穩(wěn)定性幾乎保持不變;(2)熱穩(wěn)定性的研究表明:花青素和吡喃花青素苷元水溶液在不同加熱溫度和加熱時(shí)間條件下的穩(wěn)定性顯著高于花青素苷元;(3)金屬離子穩(wěn)定性的研究表明:Fe~(3+)離子對于三種藍(lán)莓花青素提取物都具有明顯的褪色作用,而Na~+、Al~(3+)、Cu~(2+)、Mn~(2+)離子在較低濃度時(shí)則具有一定的增色效應(yīng),高濃度時(shí)也會降低樣品的吸光度值,其中金屬離子對花青素苷元的影響最大,吡喃花青素苷元和花青素則表現(xiàn)出更高的耐受性;(4)自由基清除能力的研究結(jié)果表明:以Trolox抗氧化當(dāng)量為依據(jù),三種花青素樣品對DPPH、ABTS~+自由基有很強(qiáng)的清除能力,從強(qiáng)到弱依次為:花青素苷元吡喃花青素苷元花青素。4、通過用不同濃度的吡喃花青素苷元、花青素苷元和花青素提取物處理HeLa細(xì)胞后,以MTT法檢測了其對細(xì)胞活力的影響,以Calcein-AM/PI雙染色法觀察了細(xì)胞死/活狀態(tài),并利用流式細(xì)胞儀,對細(xì)胞的周期和凋亡進(jìn)行了檢測,研究發(fā)現(xiàn),用樣品處理24h后細(xì)胞活力呈劑量依賴性下降,其中花青素苷元處理的HeLa細(xì)胞顯示出最低的IC_(50)值(275.33±1.67μg/mL),其次是吡喃花青素苷元(IC_(50)值為536.91±2.03μg/mL),而花青素的毒性最小(IC_(50)值為1095.28±1.72μg/mL)。Calcein-AM/PI雙染色研究結(jié)果與MTT法的毒性評價(jià)基本一致,均表明花青素苷元對HeLa細(xì)胞的抑制作用最強(qiáng),其次是吡喃花青素苷元,花青素作用最弱。通過流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn),三種花青素樣品能夠引起HeLa細(xì)胞周期在G_2/M期發(fā)生阻滯,并且能顯著通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來抑制HeLa細(xì)胞的增殖。5、通過蛋白質(zhì)免疫印跡分析技術(shù)檢測了HeLa細(xì)胞內(nèi)相關(guān)蛋白(p53、p38-MAPK和Caspase-3)的表達(dá)水平變化。其中p53蛋白的表達(dá)水平通常被用作G_2/M期細(xì)胞周期停滯的標(biāo)志物,并且p53和p38-MAPK的上調(diào)以及Caspase-3的激活說明HeLa細(xì)胞可能通過線粒體內(nèi)的凋亡途徑引發(fā)了細(xì)胞凋亡,從而抑制了HeLa細(xì)胞的增殖,為進(jìn)一步闡明吡喃花青素苷元影響細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡的可能機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。
【圖文】：

多家族的新型花青素衍生產(chǎn)物[23]。青素衍生物的研究起源于對釀造葡萄酒及酒渣中離純化及鑒定的研究[24]，集中在新型衍生產(chǎn)物的徑的確認(rèn)方面[25]，，目前為止，對其生物活性功能的研結(jié)構(gòu)和功能概述構(gòu)特點(diǎn)研究Anthocyanin）是一類廣泛分布于植物中的水溶性，是由花青素苷元（Anthocyanidin，羥基和甲基與一個(gè)或幾個(gè)糖分子通過糖苷鍵連接而成的天然苯環(huán)，并由一個(gè)三碳結(jié)構(gòu)聯(lián)結(jié)，呈現(xiàn) C6-C3-C6結(jié)示。

第 1 章 緒論9圖1.2 幾種主要類型吡喃花青素的分子結(jié)構(gòu)Fig.1.2 Molecular structure of several main typesof Pyranoanthocyanidin其不同種類的名稱與它本身結(jié)構(gòu)或發(fā)現(xiàn)方式都有關(guān)系，比如酚基型、甲基型，是以在C10位置的取代基的不同而命名的，而從Pinotage葡萄酒中分離鑒定的吡喃花青素，被命名為Pinotin型，從Port紅酒中分離鑒定的吡喃花青素，則被命名為Portisins型。通常酒體中自然形成的吡喃花青素需要較長的時(shí)間，新制酒中幾乎沒有吡喃花青素的生成，這與酒體中花青素與糖類的次級代謝物反應(yīng)有關(guān)，糖類發(fā)酵過程中產(chǎn)生的丙酮酸
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：O657.63;TS264.4

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 胡可;韓科廳;戴思蘭;;環(huán)境因子調(diào)控植物花青素苷合成及呈色的機(jī)理[J];植物學(xué)報(bào);2010年03期

2 劉海英;高遠(yuǎn);邢晨濤;甄俊琦;陸順麗;王玉芝;;花青素苷提取專用菊種質(zhì)及適宜采收期的篩選[J];河南農(nóng)業(yè)科學(xué);2018年09期

3 莊維兵;劉天宇;束曉春;渠慎春;翟恒華;王濤;張鳳嬌;王忠;;植物體內(nèi)花青素苷生物合成及呈色的分子調(diào)控機(jī)制[J];植物生理學(xué)報(bào);2018年11期

4 江榮高;;歐洲越桔中花青素苷的化學(xué)結(jié)構(gòu)對其HPLC分離的影響[J];國外醫(yī)藥(植物藥分冊);2005年04期

5 應(yīng)震;李紀(jì)元;殷恒福;范正琪;倪穗;吳斌;呂燾;;紅葉山茶品種花青素苷相關(guān)基因表達(dá)水平及代謝產(chǎn)物分析[J];林業(yè)科學(xué)研究;2017年06期

6 張芹;徐宗大;趙凱;李曉偉;張羅沙;張啟翔;;梅花花青素苷調(diào)控基因PmMYB1的分離及功能分析[J];林業(yè)科學(xué);2018年10期

7 崔超軍;李嘉敏;陳君宇;張潤釗;祝欽瀧;;煙草花青素苷轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因NtAN9的分離與表達(dá)分析[J];西北植物學(xué)報(bào);2016年07期

8 李惠蓮;楊劍芳;馬林;;黑果越桔花青素苷在酸性介質(zhì)中的水解[J];國外醫(yī)藥(植物藥分冊);2002年05期

9 柯q

本文編號：2708433