【摘要】：食源性生物活性肽具有安全性高、易吸收、來(lái)源廣等多種優(yōu)點(diǎn),越來(lái)越受到科研學(xué)者的關(guān)注。然而,受傳統(tǒng)分離純化技術(shù)效率限制,目前已報(bào)道的生物活性肽段序列很少,因此,發(fā)展一種可同時(shí)實(shí)現(xiàn)食源性蛋白水解物快速分離、活性肽段檢測(cè)和結(jié)構(gòu)鑒定的技術(shù)手段是目前亟需解決的問(wèn)題。本文分別探討了肽分子在停流型二維液相色譜(2D-LC)中第一維凝膠色譜(SEC)和反相色譜(RPLC)的額外峰展寬情況,并對(duì)現(xiàn)有二維色譜峰檢測(cè)方法進(jìn)行了一系列改善,在此基礎(chǔ)上,構(gòu)建了快速停流型SEC×RPLC-MS系統(tǒng)用于改善食源性蛋白水解物中肽段的分離和鑒定,與此同時(shí),本文進(jìn)一步構(gòu)建了停流型RPLC×SEC-MS/DPPH自由基清除活性分析系統(tǒng),用于食源性蛋白水解物中活性肽段的快速檢測(cè)和鑒定。本文主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下:(1)構(gòu)建了一種常規(guī)全自動(dòng)停流型SEC×RPLC二維液相色譜,并系統(tǒng)研究了停流操作對(duì)停流型2D-LC中第一維SEC分離的影響,結(jié)果表明:大分子蛋白質(zhì)或多肽在第一維SEC停流分析過(guò)程中的額外峰展寬極小,而小分子肽的額外峰展寬相對(duì)較大,但可通過(guò)調(diào)整其停流時(shí)間和分析溫度對(duì)其進(jìn)行控制,此外,停流位置和停流次數(shù)對(duì)樣品在第一維SEC中的額外峰展寬影響極小。將該停流型SEC×RPLC應(yīng)用于花生蛋白水解物的分離,獲得了明顯優(yōu)于單維液相色譜的分離效果,其全二維分離峰容量高達(dá)504。(2)在停流型SEC×RPLC的基礎(chǔ)上,將兩個(gè)維度的色譜柱互換并對(duì)閥切換結(jié)構(gòu)進(jìn)行改良,進(jìn)一步構(gòu)建了一種可用于蛋白水解物分子量分析的常規(guī)停流型RPLC×SEC二維液相色譜,并系統(tǒng)性研究了第一維RPLC的額外峰展寬情況,結(jié)果表明:分子量較大或保留時(shí)間較長(zhǎng)的物質(zhì)在第一維RPLC中額外峰展寬均較小,僅有保留時(shí)間較短的小分子物質(zhì)存在較為嚴(yán)重的額外峰展寬。將該停流型RPLC×SEC用于食源性蛋白水解物的分離分析,發(fā)現(xiàn)第一維RPLC分離可大大降低第二維SEC的分離難度,改善其分離效果。與停流型SEC×RPLC相比,停流型RPLC×SEC的全二維分離速度較慢且峰容量較低(僅為200左右),但該系統(tǒng)可用于測(cè)定第一維RPLC全流出組分的分子量分布情況,同時(shí),還可用于更準(zhǔn)確地測(cè)定第一維RPLC特定流出組分的分子量。(3)基于原兩步檢測(cè)法,對(duì)二維液相色譜峰檢測(cè)方法進(jìn)行了改良。在新方法中,引入了保留時(shí)間判定和雙向峰重疊判定,其中保留時(shí)間判定可根據(jù)第一維流出組分的不同采取不同的色譜峰偏移閾值,以適用于采用可變第二維液相色譜梯度的二維液相色譜峰檢測(cè),而雙向峰重疊可支持設(shè)定峰寬對(duì)比高度,以減小峰拖尾對(duì)二維液相色譜峰檢測(cè)的影響。新方法在常規(guī)分離、第一維欠采樣和第二維采用可變梯度時(shí)所獲得的復(fù)雜二維液相色譜數(shù)據(jù)中均獲得了較好的檢測(cè)效果,正確檢測(cè)率均高于60%。與原Peters方法相比,新方法所得二維色譜峰檢測(cè)的正確率至少提高了6%。(4)對(duì)常規(guī)停流型SEC×RPLC的第二維液相色譜(~2D-LC)進(jìn)行升級(jí),構(gòu)建了一種基于常規(guī)離子源的快速停流型SEC×RPLC-MS系統(tǒng),并對(duì)其分離條件進(jìn)行了優(yōu)化,應(yīng)用于食源性蛋白水解物的肽組學(xué)分析。結(jié)果表明:超高效UPLC SEC與HSS T3柱可作為食源性蛋白水解物二維分離的較優(yōu)色譜柱對(duì),結(jié)合進(jìn)一步的進(jìn)樣量、組分轉(zhuǎn)移體積及死體積優(yōu)化,該二維色譜分離效果大大改善,峰容量高達(dá)1165,體現(xiàn)了其對(duì)復(fù)雜樣品的強(qiáng)大分離能力。在玉米蛋白水解物的分離和鑒定試驗(yàn)中,快速停流型SEC×RPLC-MS的PSMs(母離子二級(jí)譜匹配數(shù)量)較傳統(tǒng)1D-LC-MS提高了至少25%,MS2采集數(shù)量提高了至少兩倍。將該系統(tǒng)進(jìn)一步應(yīng)用于大豆肽及酪蛋白水解物的肽段分離和鑒定,實(shí)際峰檢測(cè)數(shù)量均超過(guò)200,PSMs鑒定量均超過(guò)9 k,而MS2采集量更是超過(guò)了50 k,充分展現(xiàn)了快速停流型SEC×RPLC-MS對(duì)食源性蛋白水解物的強(qiáng)大分離和鑒定能力。此外,通過(guò)將該鑒定結(jié)果與Biopep活性肽段數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行對(duì)比,快速地發(fā)現(xiàn)了酪蛋白水解物中的6條已知活性肽段,同時(shí)發(fā)現(xiàn)了大量包含活性片段的潛在生物活性肽段。(5)在常規(guī)停流型RPLC×SEC的基礎(chǔ)上,對(duì)其停流型閥切換結(jié)構(gòu)進(jìn)行進(jìn)一步的改良,并對(duì)其~2D-LC進(jìn)行升級(jí),構(gòu)建了停流型RPLC×SEC-MS/DPPH自由基清除活性分析系統(tǒng)。通過(guò)探討反應(yīng)環(huán)管路長(zhǎng)短、DPPH·濃度、溫度及甲酸添加量對(duì)第二維SEC-DPPH自由基清除活性分析的影響,確定了第二維SEC-DPPH自由基清除活性分析的適宜條件為:反應(yīng)環(huán)10 m、DPPH·濃度200μM、溫度40℃、甲酸添加量0.06%。通過(guò)谷胱甘肽標(biāo)準(zhǔn)品的停流型RPLC×SEC-MS/DPPH自由基清除活性分析,對(duì)該系統(tǒng)的有效性進(jìn)行了充分驗(yàn)證,在此基礎(chǔ)上,進(jìn)一步將其應(yīng)用于復(fù)雜混合標(biāo)準(zhǔn)品的分析,成功從復(fù)雜混標(biāo)中鑒定到了具有強(qiáng)DPPH自由基清除活性的二肽GC和CW,并對(duì)上述兩種二肽進(jìn)行了驗(yàn)證,展示了該系統(tǒng)較強(qiáng)的創(chuàng)新性、有效性和實(shí)用性。
【圖文】：

圖 1-1 一種二維液相色譜的樣品環(huán)閥切換結(jié)構(gòu)示意圖-1 An advanced valve interface equipped with two sample loops comprehensive two-dimensional liquid chromatography柱接口切換接口結(jié)構(gòu)與樣品環(huán)結(jié)構(gòu)相類(lèi)似，將圖 1-1 中兩個(gè)樣品環(huán)得到補(bǔ)集柱閥切換接口[75]。在二維分析過(guò)程中，，補(bǔ)集柱的主和再解析，相比于使用樣品環(huán)，補(bǔ)集柱可以實(shí)現(xiàn)更長(zhǎng)時(shí)間的柱具備一定的溶質(zhì)濃縮效果，可使樣品組分中的溶質(zhì)“聚焦中的擴(kuò)散，另外，補(bǔ)集柱的使用可同時(shí)有利于第一維組分的EC×RPLC 中的應(yīng)用較多[76]。近年來(lái)隨著補(bǔ)集柱的不斷發(fā)展大，借助于補(bǔ)集柱的“濃縮和聚焦”作用，Wang 等人[10]利

2D-LC 的壓力波動(dòng)，不利于檢測(cè)器的穩(wěn)定，其系統(tǒng)結(jié)構(gòu)亦進(jìn)一步改進(jìn)和完善。圖1-2 一種停流型二維液相色譜流路示意圖Figure 1-2 Schematic presentation of a stop-flow two-dimensional liquid chromatography1.4 二維液相色譜分離效果評(píng)價(jià)為了評(píng)價(jià) 2D-LC 的分離效果，國(guó)內(nèi)外科研學(xué)者發(fā)展了一系列評(píng)價(jià)方法，評(píng)價(jià)指標(biāo)主要包括正交度、峰容量、實(shí)際峰檢測(cè)數(shù)量等，其中正交度主要用于衡量?jī)蓚�(gè)維度之間液相色譜分離的獨(dú)立程度[89]；峰容量用于衡量該 2D-LC 系統(tǒng)在該分析條件下對(duì)該樣品的理論分離能力[90]；實(shí)際峰檢測(cè)數(shù)量[91]用于描述該 2D-LC 對(duì)樣品的實(shí)際分離情況。1.4.1 正交度2D-LC 的正交度主要用于衡量?jī)蓚�(gè)維度之間色譜分離的相互獨(dú)立程度。為了實(shí)現(xiàn)更好的二維色譜分離效果，在當(dāng)前 1D-LC 峰容量?jī)?yōu)化至一定程度時(shí)，我們常希望在二
【學(xué)位授予單位】：華南理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：TS201.2;O657.72

【參考文獻(xiàn)】

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10 張國(guó)城;;液相色譜檢出限的推導(dǎo)與討論[J];中國(guó)計(jì)量;2010年05期

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本文編號(hào)：2670571