【摘要】：當(dāng)前,由微生物引發(fā)的食品腐敗問(wèn)題已成為食品行業(yè)關(guān)注的重點(diǎn)。豬肉作為我國(guó)肉類產(chǎn)品中主要的消費(fèi)對(duì)象,其豐富的營(yíng)養(yǎng)成分為微生物生長(zhǎng)提供了充足的物質(zhì)基礎(chǔ)。由于豬肉在宰殺、儲(chǔ)藏、加工等過(guò)程中都不可避免的被微生物污染,因此豬肉極易腐敗。豬肉的腐敗不僅會(huì)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失,甚至也會(huì)引發(fā)肉品安全問(wèn)題。本論文以冷鮮豬肉為研究對(duì)象,分析了冷鮮豬肉新鮮度隨儲(chǔ)存時(shí)間的變化,并基于高通量測(cè)序技術(shù)解析儲(chǔ)存期間微生物多樣性,明確了冷鮮豬肉儲(chǔ)藏過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)腐敗微生物,同時(shí)建立了基于屬水平上檢測(cè)優(yōu)勢(shì)腐敗微生物的熒光定量PCR(Real-time quantitative polymerase chain reaction,qPCR)和實(shí)時(shí)熒光環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)技術(shù)(Loop-mediated isothermal amplification techniques,LAMP)。本論文對(duì)超市中冷鮮豬肉儲(chǔ)藏過(guò)程中的感官品質(zhì)、pH、揮發(fā)性鹽基氮(Total volatile basic nitrogen,TVB-N)、菌落總數(shù)和微生物多樣性進(jìn)行了分析。通過(guò)對(duì)16S rDNA序列的V3-V4區(qū)進(jìn)行高通量測(cè)序分析,共鑒定出微生物分別屬于21個(gè)門、259個(gè)屬。結(jié)果表明,隨儲(chǔ)存時(shí)間的變化,微生物群落組成和多樣性發(fā)生了明顯變化。儲(chǔ)存5天后,發(fā)現(xiàn)假單胞菌屬(Pseudomonas)、不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)和發(fā)光桿菌屬(Photobacterium)成為優(yōu)勢(shì)微生物,尤其是發(fā)光桿菌屬,先前的研究中很少報(bào)道與肉類腐敗有關(guān)。研究結(jié)果表明,以上三類微生物與冷鮮豬肉的腐敗有關(guān)。儲(chǔ)存期間,pH和TVB-N的變化趨勢(shì)相似;此外,隨著菌落數(shù)持續(xù)增加,感官評(píng)分持續(xù)下降。菌落數(shù)、pH、TVB-N和感官評(píng)分的變化結(jié)果表明冷鮮豬肉在儲(chǔ)存第5天時(shí)已為非新鮮肉。采用比較基因組學(xué)的方法,對(duì)優(yōu)勢(shì)腐敗微生物假單胞菌成功篩選出了新的屬內(nèi)特異性基因sucD,該基因是琥珀酰輔酶A合成酶α亞基的編碼基因。針對(duì)sucD基因設(shè)計(jì)特異性引物,對(duì)其特異性進(jìn)行驗(yàn)證,并優(yōu)化qPCR反應(yīng)的退火溫度。以細(xì)菌純培養(yǎng)物的基因組DNA為標(biāo)準(zhǔn)品,建立了qPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明,僅12株假單胞菌出現(xiàn)大小相符的DNA擴(kuò)增條帶,其它22株非假單胞菌均無(wú)擴(kuò)增條帶,表明qPCR的引物特異性好;最佳退火溫度60℃。qPCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=-3.2034x+40.3640,R~2=0.9956,擴(kuò)增效率為105%,純培養(yǎng)物的靈敏度為8.1×10~2 CFU/mL,人工污染樣品的檢出限為7.8×10~3CFU/g,人工污染樣品的qPCR檢測(cè)結(jié)果和平板計(jì)數(shù)之間的Pearson相關(guān)系數(shù)為0.9980,相關(guān)性好。根據(jù)假單胞菌16S rDNA序列設(shè)計(jì)引物,并向反應(yīng)體系中加入飽和型核酸染料Eva Green,基于實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)儀建立并優(yōu)化了假單胞菌屬實(shí)時(shí)熒光LAMP檢測(cè)技術(shù)。通過(guò)12株假單胞菌和23株非假單胞菌對(duì)引物特異性進(jìn)行了驗(yàn)證,并比較了實(shí)時(shí)熒光LAMP與普通LAMP檢測(cè)技術(shù)的靈敏度差異,同時(shí)對(duì)人工污染樣品的檢出限進(jìn)行了測(cè)定。研究結(jié)果顯示,12株假單胞菌為陽(yáng)性,23株非假單胞菌為陰性,表明實(shí)時(shí)熒光LAMP的引物特異性高;反應(yīng)的最佳體系濃度為:6 mmol/L Mg~(2+),1.0 mmol/L dNTPs,0.30 mol/L甜菜堿,F3/B3:LF:FIP/BIP=1:4:8(1=0.2μmol/L),退火溫度為65℃。實(shí)時(shí)熒光LAMP檢測(cè)細(xì)菌純培養(yǎng)物的靈敏度為3.2×10~1 CFU/mL,是普通LAMP檢測(cè)靈敏度的10倍。人工污染樣品的檢出限為1.7×10~3 CFU/g,實(shí)時(shí)熒光LAMP技術(shù)可在2.5 h內(nèi)完成冷鮮豬肉中假單胞菌的檢測(cè)。
【圖文】：

LAMP擴(kuò)增原理圖

15圖 2-1 4℃儲(chǔ)存期間冷鮮豬肉 pH 和 TVB-N 的變化Fig. 2-1 Changes in pH and TVB-N of refrigerated pork during storage at 4℃注：（A）pH 變化；（B）TVB-N 變化。
【學(xué)位授予單位】：江南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：TS251.51

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本文編號(hào)：2653502