【摘要】：本論文利用二步酶解法制備魚(yú)鱗明膠抗氧化肽,通過(guò)響應(yīng)面試驗(yàn)確定最優(yōu)的二步酶解工藝,探究經(jīng)最優(yōu)工藝制備的水解物(ATHs)對(duì)過(guò)氧化氫(H2O2)介導(dǎo)的氧化損傷Hep G2細(xì)胞的保護(hù)作用,通過(guò)Nano-LC-ESI-Q-Orbitrap-MS/MS和De novo測(cè)序法鑒定ATHs中多肽的結(jié)構(gòu),并進(jìn)一步篩選出活性較強(qiáng)的抗氧化肽。本論文可為魚(yú)鱗明膠抗氧化肽的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用提供理論指導(dǎo)。(1)以草魚(yú)魚(yú)鱗為原料提取魚(yú)明膠,通過(guò)堿性蛋白酶進(jìn)行第一步酶解,胰蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、木瓜蛋白酶和胃蛋白酶分別進(jìn)行第二步酶解制備魚(yú)鱗明膠抗氧化肽,結(jié)果表明二步酶解法能有效提高水解度,增大可溶性蛋白的含量,降低水解物的分子量。堿性蛋白酶-胰蛋白酶水解物具有較強(qiáng)的抗氧化能力,1mg/m L堿性蛋白酶-胰蛋白酶水解物的DPPH·、·OH、O2-·清除率分別是16.98%、92.28%和43.11%,Fe2+螯合率是63.26%,其·OH清除率和Fe2+螯合率均高于同濃度的BHT(分別是60.48%和49.57%),具有替代人工合成抗氧化劑的應(yīng)用前景。(2)采用單因素試驗(yàn)分別探究胰蛋白酶第二步酶解的時(shí)間、溫度、底物濃度和p H值對(duì)堿性蛋白酶-胰蛋白酶水解物的Fe2+螯合率及組分IV的相對(duì)含量的影響。通過(guò)響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化確定堿性蛋白酶-胰蛋白酶二步酶解的最優(yōu)工藝條件為:底物濃度100 mg/m L、p H值7.8、酶解溫度53°C、時(shí)間50 min。根據(jù)最優(yōu)工藝制備的ATHs的Fe2+螯合率為65.72%,組分IV的相對(duì)含量為53.36%,清除DPPH·、·OH和O2-·的IC50值分別是7.39 mg/m L、0.68 mg/m L和1.84 mg/m L。(3)以800μM的H2O2培養(yǎng)2 h建立氧化損傷Hep G2細(xì)胞模型,通過(guò)MTT法和流式細(xì)胞儀分別檢測(cè)Hep G2細(xì)胞的存活率和凋亡率,結(jié)果表明0.19~3.00mg/m L的ATHs預(yù)先處理24 h可明顯提高Hep G2細(xì)胞的存活率,降低其凋亡率。ATHs可保護(hù)Hep G2細(xì)胞抵御H2O2介導(dǎo)的氧化損傷,這主要?dú)w因于ATHs可提高Hep G2細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶(SOD、CAT和GPX)的活力從而降低Hep G2細(xì)胞內(nèi)ROS水平、MDA含量和DNA的損傷程度。在所選的濃度范圍內(nèi),0.19mg/m L的ATHs對(duì)H2O2介導(dǎo)的氧化損傷Hep G2細(xì)胞的保護(hù)作用最明顯。(4)通過(guò)Nano-LC-ESI-Q-Orbitrap-MS/MS和De novo測(cè)序法鑒定ATHs中31條ALC99%的多肽的結(jié)構(gòu),從中選擇9條多肽進(jìn)行合成。在9條合成的多肽中,YGPR和LLGFDNVR具有較強(qiáng)的·OH清除能力,2.5 mg/m L YGPR和LLGFDNVR的·OH清除率分別是34.97%和33.11%。VGPS和FPFLR具有較強(qiáng)的Fe2+螯合能力,2.5 mg/m L VGPS和FPFLR的Fe2+螯合率分別是16.04%和25.74%。SGLDGAK兼具較強(qiáng)的·OH清除能力和Fe2+螯合能力,2.5 mg/m L SGLDGAK的·OH清除率和Fe2+螯合率分別是33.11%和14.97%。合成的9條多肽的·OH清除能力和Fe2+螯合能力均低于ATHs,這可能是由于多肽之間存在相互作用。
【圖文】：

圖 1.1 42 條抗氧化肽的分子量Figure 1.1 The molecular weight of 42 antioxidant peptides]進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)了 42 條抗氧化肽的各個(gè)氨基酸占總氨酸氨酸（G）、脯氨酸（P）和亮氨酸（L）所占的比例分次數(shù)最多。一些研究結(jié)果表明某些特殊氨基酸，如芳-/C-端的酪氨酸（Y）可以提供質(zhì)子或者通過(guò)電子傳遞化活性是有利的[47，，48]。多肽的 N-端或 C-端存在疏在油-水界面的溶解從而提高多肽對(duì)脂相中自由基的的酸性氨基酸如 E 和 D 的多肽由于存在過(guò)量的電子活性，但 Fe2+螯合能力較低[49]。洞悉分子量、氨基酸特征因素與多肽的抗氧化活性的聯(lián)系可用于指導(dǎo)抗

圖 1.1 42 條抗氧化肽的分子量Figure 1.1 The molecular weight of 42 antioxidant peptid[44]進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)了 42 條抗氧化肽的各個(gè)氨基酸占總甘氨酸（G）、脯氨酸（P）和亮氨酸（L）所占的比的次數(shù)最多。一些研究結(jié)果表明某些特殊氨基酸，如 N-/C-端的酪氨酸（Y）可以提供質(zhì)子或者通過(guò)電子氧化活性是有利的[47，48]。多肽的 N-端或 C-端存在肽在油-水界面的溶解從而提高多肽對(duì)脂相中自由基荷的酸性氨基酸如 E 和 D 的多肽由于存在過(guò)量的滅活性，但 Fe2+螯合能力較低[49]。洞悉分子量、氨構(gòu)特征因素與多肽的抗氧化活性的聯(lián)系可用于指導(dǎo)
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：TS254.9

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本文編號(hào)：2606185