巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris）是甲醇營養(yǎng)型酵母中的一類能夠利用甲醇作為唯一碳源和能源的酵母菌。它含有兩個醇氧化酶基因,aox1和aox2,它們具有強誘導型啟動子,可被甲醇誘導并被葡萄糖、甘油抑制。由于巴斯德畢赤酵母具有高生長速率,能夠在簡單、廉價的培養(yǎng)基中生長,適合用于小規(guī)模發(fā)酵和大規(guī)模生產,且具有真核表達系統(tǒng)的翻譯后修飾機制,而被廣泛地用于重組DNA技術生產蛋白質。Gt1（glycerol transporter 1,GenBank:CP014715.1）基因編碼巴斯德畢赤酵母的甘油轉運體1（GT1）。GT1是跨膜蛋白,具有將甘油從胞外轉運至胞內的功能。根據前期研究,在畢赤酵母GS115△gt1中,zrt1（GenBank:CP014717.1）的mRNA水平增高,暗示著GT1可能與ZRT1具有功能相似性,GT1能夠行使轉運甘油之外的其他功能。首先根據NCBI分析比對,畢赤酵母zrt1與釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中編碼高親和力鋅轉運蛋白的zrt1（zinc-regulated transporter 1,GenBank:CP02916...

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【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 緒論
    1.1 膜蛋白概述
        1.1.1 細胞質膜
        1.1.2 膜蛋白的功能
        1.1.3 MFS蛋白超家族
        1.1.4 ZIP和 Zn T蛋白超家族
    1.2 酵母細胞的鋅穩(wěn)態(tài)簡介
        1.2.1 鋅在細胞水平發(fā)揮的功能及作用
        1.2.2 酵母細胞鋅穩(wěn)態(tài)的調控模式
    1.3 課題研究目的及意義
        1.3.1 課題研究目的
        1.3.2 課題研究意義
    1.4 主要研究內容
第二章 材料與方法
    2.1 實驗材料
        2.1.1 菌種及質粒
        2.1.2 主要試劑和材料
        2.1.3 培養(yǎng)基
        2.1.4 主要溶液
        2.1.5 主要設備儀器
    2.2 實驗方法
        2.2.1 大腸桿菌感受態(tài)的制備
        2.2.2 質粒提取方法
        2.2.3 DNA片段的回收
        2.2.4 酶切連接
        2.2.5 熱激法轉化大腸桿菌
        2.2.6 陽性克隆的篩選
        2.2.7 GT1表達宿主、發(fā)酵條件、去污劑的篩選
        2.2.8 GT1和ZRT1的純化
        2.2.9 SDS-PAGE和 Western Blot檢測
        2.2.10 酵母感受態(tài)的制備與電轉化
        2.2.11 CRISPR/Cas9 敲除gt1和zrt1
        2.2.12 酵母基因組提取
        2.2.13 酵母蛋白提取
        2.2.14 亞細胞定位的檢測
        2.2.15 熒光定量PCR
        2.2.16 等溫滴定量熱(ITC)實驗
        2.2.17 鋅離子熒光定量
        2.2.18 胞外甘油含量的測定
第三章 結果與討論
    3.1 GT1、ZRT1的生物信息學分析
    3.2 菌株構建
        3.2.1 GT1和ZRT1表達重組質粒的構建
        3.2.2 △gt1和△zrt1敲除菌株的構建
        3.2.3 HA標簽、RFP融合表達菌株的構建
    3.3 GT1異源表達的條件優(yōu)化
        3.3.1 重組蛋白重溶解去垢劑的篩選
        3.3.2 重組蛋白表達宿主的選擇
        3.3.3 重組蛋白表達條件的優(yōu)化
    3.4 重組蛋白的純化與Western Blot檢測
    3.5 GT1和ZRT1與ZnCl₂的ITC檢測
    3.6 GT1和ZRT1的體內功能鑒定
        3.6.1 GT1和ZRT1的亞細胞定位
        3.6.2 GT1和ZRT1鋅轉運能力的鑒定
    3.7 鋅對GT1和ZRT1 m RNA和蛋白表達的調控
    3.8 葡萄糖和甘油介導的GT1和ZRT1 m RNA和蛋白表達的調控
主要結論與展望
    主要結論
    展望
致謝
參考文獻
附錄 :作者在攻讀碩士學位期間發(fā)表的論文



本文編號：4008364