α-氟羧酸(α-fluorocarboxylic acids,FCAs)由于其固有的生物活性和作為構(gòu)建更復雜藥物分子的前體,受到了廣泛的關(guān)注。目前合成手性α-氟取代的羧酸類化合物主要通過化學方法,然而傳統(tǒng)的化學方法操作復雜,立體選擇性差,金屬催化劑的使用也容易造成環(huán)境污染等問題。近年來隨著生物催化的發(fā)展,相對于化學催化,生物催化往往能在溫和的條件下實現(xiàn)反應(yīng),具有綠色環(huán)保,催化效率高,對映選擇性好等優(yōu)點,因此發(fā)展生物催化的方法來制備這一類有機氟化物對于整個有機氟化學領(lǐng)域都是一個重要的推動。然而酶本身也具有熱穩(wěn)定性低,以及針對非天然底物催化效率低等特性,這些缺點嚴重阻礙了它們的廣泛應(yīng)用。而隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展,基因合成以及測序成本的降低,一系列的方法工具(基因挖掘,定向進化計算機輔助設(shè)計等等)也被開發(fā)出來,有效彌補了這些缺點,全面地推動了生物催化在有機化學領(lǐng)域的開發(fā)和利用。前期的工作中發(fā)現(xiàn)氟乙酸脫鹵酶RPA1163可以特異催化(S)構(gòu)型的α-氟代苯乙酸以及α-氟代苯丙酸脫氟水解生成對應(yīng)的(R)構(gòu)型的α-羥基苯乙酸以及α-羥基苯丙酸,具有手性拆分的潛在用途。但以前的研究主要集中在研究水解脫...

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【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
中文摘要
Abstract
第一章 緒論
    1.1 手性含氟有機化合物
        1.1.1 手性含氟有機物研究的意義
        1.1.2 手性含氟有機化合物的化學合成
    1.2 生物催化
        1.2.1 生物催化概述
        1.2.2 生物催化劑的產(chǎn)生和發(fā)展
        1.2.3 生物催化在有機合成中的發(fā)展
        1.2.4 生物催化在有機合成中的優(yōu)點
    1.3 蛋白定向進化
        1.3.1 蛋白定向進化的意義
        1.3.2 蛋白定向進化的概念
        1.3.3 蛋白定向進化的應(yīng)用
    1.4 氟乙酸脫鹵酶
        1.4.1 氟乙酸脫鹵酶的研究背景
        1.4.2 氟乙酸脫鹵酶的研究進展
        1.4.3 氟乙酸脫鹵酶的催化機理
    1.5 本論文的選題意義及主要內(nèi)容
第二章 氟乙酸脫鹵酶RPA1163動力學拆分α-氟代苯乙酸
    2.1 引言
    2.2 實驗部分
        2.2.1 儀器
        2.2.2 試劑
        2.2.3 實驗室常規(guī)操作
        2.2.4 表達質(zhì)粒的構(gòu)建
        2.2.5 探究酶的表達條件
        2.2.6 蛋白RPA1163純化
        2.2.7 底物合成
        2.2.8 活性測試
        2.2.9 RPA1163穩(wěn)定性研究
        2.2.10 反應(yīng)條件優(yōu)化
        2.2.11 反應(yīng)進程
        2.2.12 TON的計算
    2.3 結(jié)果與討論
        2.3.1 表達質(zhì)粒的構(gòu)建
        2.3.2 表達條件的優(yōu)化
        2.3.3 酶穩(wěn)定性測試
        2.3.4 反應(yīng)條件優(yōu)化
        2.3.5 反應(yīng)時間
        2.3.6 拓展底物譜
    2.4 .小結(jié)
第三章 半理性設(shè)計改造氟乙酸脫鹵酶用于低活性α-氟代羧酸的不對稱拆分
    3.1 引言
    3.2 實驗部分
        3.2.1 儀器
        3.2.2 試劑
        3.2.3 C-F鍵解離能測定
        3.2.4 動力學數(shù)據(jù)測試
        3.2.5 同位素動力學數(shù)據(jù)測試
        3.2.6 QM/MM計算同位素效應(yīng)
        3.2.7 QM/MM計算能量差
        3.2.8 哈米特圖
        3.2.9 對接
        3.2.10 突變體的構(gòu)建
        3.2.11 突變體活性測試
        3.2.12 分子動力學模擬
        3.2.13 粘度動力學數(shù)據(jù)的測試
    3.3 結(jié)果與討論
        3.3.1 C-F鍵解離能測定
        3.3.2 動力學數(shù)據(jù)的測定
        3.3.3 限速步的確定
        3.3.4 半理性設(shè)計構(gòu)建突變體
        3.3.5 突變體動力學數(shù)據(jù)測試
        3.3.6 QM/MM計算
        3.3.7 分子動力學(MD)模擬
        3.3.8 粘度動力學實驗
    3.4 小結(jié)
第四章 克級制備α-氟代羧酸和α-羥基酸
    4.1 引言
    4.2 實驗部分
        4.2.1 儀器
        4.2.2 試劑
        4.2.3 氟乙酸脫鹵酶RPA1163凍干粉的制備
        4.2.4 總轉(zhuǎn)化數(shù)(TON)的計算
        4.2.5 突變體熱穩(wěn)定性實驗
        4.2.6 大量制備
        4.2.7 (R)-2-氟代羧酸和(R)-2-羥基羧酸的分離
    4.3 結(jié)果與討論
        4.3.1 總轉(zhuǎn)化數(shù)(TON)的計算
        4.3.2 突變體熱穩(wěn)定性
        4.3.3 大量制備實驗
        4.3.4 (R)-3,5-二氟苯基-氟乙酸(2g)的結(jié)晶學細節(jié)
    4.4 小結(jié)
結(jié)語
參考文獻
附錄
碩士期間發(fā)表的相關(guān)論文
致謝



本文編號：3870962