腈水合酶(Nitrile hydratase,簡(jiǎn)稱(chēng)NHase;EC:4.2.1.84)能夠催化腈在常溫中性條件下與水化合形成酰胺,是替代高溫強(qiáng)酸催化工藝實(shí)現(xiàn)酰胺類(lèi)大宗化學(xué)品綠色制造的關(guān)鍵酶種。常見(jiàn)NHase是含?和?亞基的金屬酶,酶的成熟遵循亞基自身交換機(jī)制。但酶的熱穩(wěn)定性和有機(jī)溶劑耐受性較差,難以滿(mǎn)足工業(yè)化生產(chǎn)對(duì)酶學(xué)性質(zhì)的應(yīng)用要求。因此,亟需發(fā)掘新型NHase,改良酶的催化性能。本研究依據(jù)新發(fā)現(xiàn)的領(lǐng)鞭毛蟲(chóng)(Monosiga brevicollis)單肽鏈腈水合酶的蛋白結(jié)構(gòu)特點(diǎn),對(duì)惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida 5B/NRRL-18668)腈水合酶進(jìn)行亞基融合重構(gòu),大幅提高腈水合酶的熱穩(wěn)定性和產(chǎn)物耐受性;又研究了來(lái)源于P.putida 5B和玫瑰色紅球菌(Rhodococcus rhodochrous J1)的腈水合酶亞基融合突變體的活化機(jī)理,揭示了調(diào)控蛋白對(duì)于融合型腈水合酶的激活機(jī)制。主要研究結(jié)果如下:(1)對(duì)P.putida 5B來(lái)源的腈水合酶PpNHase進(jìn)行亞基融合重構(gòu),獲得了活性和穩(wěn)定性均大幅提高的亞基融合型腈水合酶。基于M.brevicollis單鏈腈水...

【文章頁(yè)數(shù)】：99 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 緒論
    1.1 腈類(lèi)化合物
        1.1.1 腈類(lèi)化合物的作用
        1.1.2 腈類(lèi)的微生物轉(zhuǎn)化
    1.2 腈水合酶
        1.2.1 腈水合酶
        1.2.2 腈水合酶的催化機(jī)理
        1.2.3 腈水合酶的來(lái)源及基因結(jié)構(gòu)
    1.3 翻譯后修飾
        1.3.1 亞基自身交換
        1.3.2 金屬伴隨子
    1.4 腈水合酶的工業(yè)應(yīng)用
    1.5 腈水合酶的改造
        1.5.1 腈水合酶生產(chǎn)存在的問(wèn)題
        1.5.2 大腸桿菌的異源表達(dá)
        1.5.3 腈水合酶穩(wěn)定性改造策略
    1.6 本文研究?jī)?nèi)容
        1.6.1 立題依據(jù)及研究意義
        1.6.2 本文主要研究?jī)?nèi)容
第二章 亞基融合型腈水合酶的構(gòu)建
    2.1 前言
    2.2 材料與方法
        2.2.1 菌株與載體
        2.2.2 實(shí)驗(yàn)試劑
        2.2.3 實(shí)驗(yàn)儀器
        2.2.4 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件
        2.2.5 基因操作
        2.2.6 蛋白表達(dá)及純化
        2.2.7 酶活測(cè)定
        2.2.8 鈷含量測(cè)定
        2.2.9 最適pH測(cè)定
        2.2.10 熱穩(wěn)定性測(cè)定
        2.2.11 產(chǎn)物耐受性測(cè)定
    2.3 結(jié)果與討論
        2.3.1 融合型腈水合酶的構(gòu)建及表達(dá)
        2.3.2 融合型腈水合酶的表征
        2.3.3 調(diào)控蛋白融合位置的影響
        2.3.4 融合型腈水合酶的理化性質(zhì)測(cè)定
    2.4 本章小結(jié)
第三章 融合型腈水合酶的熱穩(wěn)定性改造
    3.1 前言
    3.2 材料與方法
        3.2.1 菌株質(zhì)粒
        3.2.2 實(shí)驗(yàn)儀器
        3.2.3 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件
        3.2.4 基因操作
        3.2.5 蛋白表達(dá)及純化
        3.2.6 酶活及動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定
        3.2.7 動(dòng)力學(xué)及熱力學(xué)穩(wěn)定性測(cè)定
        3.2.8 同源建模
        3.2.9 計(jì)算模擬
    3.3 結(jié)果與討論
        3.3.1 融合型腈水合酶的同源建模
        3.3.2 融合型腈水合酶突變體庫(kù)的構(gòu)建
        3.3.3 突變體的篩選
        3.3.4 正向突變體的酶學(xué)表征
        3.3.5 正向突變體的結(jié)構(gòu)分析
        3.3.6 正向突變體分子間相互作用探究
    3.4 本章小結(jié)
第四章 融合型腈水合酶成熟機(jī)理探究
    4.1 前言
    4.2 材料與方法
        4.2.1 菌株與載體
        4.2.2 實(shí)驗(yàn)儀器
        4.2.3 蛋白表達(dá)與純化
        4.2.4 腈水合酶的體外激活
        4.2.5 紫外-可見(jiàn)光掃描
        4.2.6 基于NanoLC-ESI-MS/MS的半胱氨酸氧化狀態(tài)測(cè)定
    4.3 結(jié)果與討論
        4.3.1 融合型腈水合酶的體外激活
        4.3.2 腈水合酶的紫外—可見(jiàn)光光譜掃描
        4.3.3 融合型腈水合酶活性中心的翻譯后修飾分析
        4.3.4 融合型腈水合酶成熟機(jī)理
    4.4 本章小結(jié)
第五章 調(diào)控蛋白的金屬伴隨子功能探究
    5.1 前言
    5.2 材料與方法
        5.2.1 菌株與載體
        5.2.2 實(shí)驗(yàn)儀器
        5.2.3 質(zhì)粒構(gòu)建
        5.2.4 蛋白表達(dá)與純化
        5.2.5 酶活與動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定
        5.2.6 鈷離子的光譜掃描及含量測(cè)定
        5.2.7 鈷離子與調(diào)控蛋白的結(jié)合
        5.2.8 測(cè)定調(diào)控蛋白與腈水合酶的結(jié)合
        5.2.9 從頭建模及分子動(dòng)力學(xué)模擬
    5.3 結(jié)果與討論
        5.3.1 調(diào)控蛋白對(duì)融合型腈水合酶活性的影響
        5.3.2 單獨(dú)調(diào)控蛋白的獲取
        5.3.3 單獨(dú)調(diào)控蛋白的表征
        5.3.4 單獨(dú)調(diào)控蛋白對(duì)融合型腈水合酶的體外激活
        5.3.5 異源調(diào)控蛋白對(duì)融合型腈水合酶的體內(nèi)激活
        5.3.6 鈷離子與調(diào)控蛋白體外結(jié)合的分析
        5.3.7 調(diào)控蛋白與脫輔基酶的結(jié)合分析
        5.3.8 調(diào)控蛋白模型的建立及動(dòng)力學(xué)分析
        5.3.9 調(diào)控蛋白鈷離子結(jié)合位點(diǎn)的分析
        5.3.10 金屬伴隨子激活模型
    5.4 本章小結(jié)
第六章 天然融合型腈水合酶成熟機(jī)理探究
    6.1 前言
    6.2 材料與方法
        6.2.1 菌株與載體
        6.2.2 培養(yǎng)條件
        6.2.3 基因合成及密碼子優(yōu)化
        6.2.4 包涵體的檢測(cè)
        6.2.5 蛋白表達(dá)與純化
        6.2.6 酶活及熱穩(wěn)定性測(cè)定
    6.3 結(jié)果與討論
        6.3.1 M.brevicollis天然融合型腈水合酶的異源表達(dá)
        6.3.2 M.brevicollis天然融合型腈水合酶的表達(dá)優(yōu)化
        6.3.3 M.brevicollis天然融合型腈水合酶的活性及熱穩(wěn)定性
        6.3.4 異源調(diào)控蛋白對(duì)M.brevicollis天然融合型腈水合酶的激活
    6.4 本章小結(jié)
主要結(jié)論與展望
    主要結(jié)論
    展望
論文創(chuàng)新點(diǎn)
致謝
參考文獻(xiàn)
附錄 ：作者在攻讀博士期間發(fā)表的論文



本文編號(hào)：3847062