谷胱甘肽(glutathione,GSH)因其具有良好的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、抗氧化性和解毒功能而被廣泛運(yùn)用于食品、化妝品和醫(yī)藥行業(yè)。目前生產(chǎn)谷胱甘肽最主要的方法是微生物發(fā)酵法。與傳統(tǒng)的化學(xué)合成法和酶法相比,該方法具有生產(chǎn)成本低、操作簡(jiǎn)單、無(wú)需外源添加ATP和輔助因子等優(yōu)勢(shì)。重組畢赤酵母(Pichia pastoris)由于蛋白表達(dá)量高、易實(shí)現(xiàn)高密度培養(yǎng)等優(yōu)點(diǎn),已初步顯示出在工業(yè)上生產(chǎn)谷胱甘肽的價(jià)值。本研究以異源表達(dá)來(lái)源于釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)S288c的谷胱甘肽酶基因(gsh1和gsh2)的重組畢赤酵母GS115為出發(fā)菌株,從誘變育種、拷貝數(shù)的篩選、產(chǎn)物分解代謝途徑的改造、外源基因的整合和搖瓶發(fā)酵條件的優(yōu)化這些方面來(lái)提高產(chǎn)物谷胱甘肽的合成效率。主要研究?jī)?nèi)容及結(jié)論如下:(1)將重組畢赤酵母GS115進(jìn)行紫外和甲基磺酸乙酯復(fù)合誘變,以谷胱甘肽類似物乙硫氨酸作為篩選劑。將紫外誘變的時(shí)間設(shè)置為40 s,甲基磺酸乙酯誘變劑的濃度為0.4 mg·mL^-1,乙硫氨酸篩選劑的濃度為0.8 g·L^-1,篩選后獲得一株穩(wěn)定遺傳的正向突...

【文章頁(yè)數(shù)】：54 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 緒論
    1.1 谷胱甘肽概述
        1.1.1 谷胱甘肽
        1.1.2 谷胱甘肽的生理功能
        1.1.3 谷胱甘肽的應(yīng)用
    1.2 谷胱甘肽的主要生產(chǎn)方法及現(xiàn)狀
        1.2.1 提取法
        1.2.2 化學(xué)合成法
        1.2.3 酶法合成
        1.2.4 發(fā)酵法
    1.3 表達(dá)宿主
    1.4 本課題的立題依據(jù)和研究意義
    1.5 研究?jī)?nèi)容
第二章 材料與方法
    2.1 材料
        2.1.1 菌株與質(zhì)粒
        2.1.2 主要試劑
        2.1.3 主要儀器
        2.1.4 培養(yǎng)基
        2.1.5 流動(dòng)相與緩沖液
    2.2 方法
        2.2.1 分子生物學(xué)操作方法
        2.2.2 谷胱甘肽的檢測(cè)
        2.2.3 菌體培養(yǎng)方法
        2.2.4 誘變及篩選方法
        2.2.5 表達(dá)載體的構(gòu)建與高拷貝基因的篩選
        2.2.6 CRISPR/Cas9敲除dug基因的方法
        2.2.7 質(zhì)粒vgb的構(gòu)建和表達(dá)方法
        2.2.8 發(fā)酵優(yōu)化方法
第三章 結(jié)果與討論
    3.1 高產(chǎn)谷胱甘肽畢赤酵母的選育
        3.1.1 誘變方法和劑量的確定
        3.1.2 高產(chǎn)菌株的篩選
        3.1.3 突變株傳代穩(wěn)定性驗(yàn)證
        3.1.4 突變菌株與原始菌株的特性研究
    3.2 谷胱甘肽合成酶GSH1和GSH2 的過(guò)表達(dá)
        3.2.1 gsh1和gsh2 過(guò)表達(dá)菌株的構(gòu)建和驗(yàn)證
        3.2.2 具有高拷貝基因(gsh1和gsh2)畢赤酵母的篩選
        3.2.3 過(guò)表達(dá)gsh1和gsh2 基因?qū)Ξ叧嘟湍干L(zhǎng)和產(chǎn)谷胱甘肽的影響
    3.3 畢赤酵母中谷胱甘肽降解途徑(Dug途徑)相關(guān)酶基因的敲除
        3.3.1 Dug敲除菌株的構(gòu)建和分子鑒定
        3.3.2 敲除dug酶基因?qū)Ξ叧嘟湍钢泄入赘孰漠a(chǎn)量的影響
    3.4 透明顫菌血紅蛋白(VHb)在產(chǎn)谷胱甘肽畢赤酵母中的表達(dá)
        3.4.1 表達(dá)VHb的畢赤酵母工程菌株的構(gòu)建
        3.4.2 CO差視光譜法檢測(cè)透明顫菌血紅蛋白的活性
        3.4.3 表達(dá)VHb對(duì)畢赤酵母生長(zhǎng)和產(chǎn)谷胱甘肽的影響
    3.5 畢赤酵母生產(chǎn)谷胱甘肽發(fā)酵條件的優(yōu)化
        3.5.1 發(fā)酵培養(yǎng)基中三種前體氨基酸初始添加量的優(yōu)化
        3.5.2 接種量的優(yōu)化
        3.5.3 補(bǔ)料時(shí)間點(diǎn)和補(bǔ)料量的優(yōu)化
        3.5.4 發(fā)酵溫度的優(yōu)化
主要結(jié)果與展望
    主要結(jié)論
    展望
致謝
參考文獻(xiàn)
附錄 :作者在攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的論文



本文編號(hào)：3834004