T1脂肪酶是重要的工業(yè)用酶之一,在實(shí)際工業(yè)應(yīng)用中經(jīng)常會受到高溫、高壓、極端pH等條件的脅迫,導(dǎo)致酶的穩(wěn)定性和催化活性大打折扣,即魯棒性較差,最終造成生產(chǎn)損失率高、生產(chǎn)成本增加等問題。因此,對T1脂肪酶進(jìn)行合理改造獲得魯棒性強(qiáng)的突變體脂肪酶以擴(kuò)大該酶的應(yīng)用價值顯得尤為重要。針對極端條件下T1脂肪酶魯棒性較差的現(xiàn)狀,本研究在高壓擾動條件下對蓋子結(jié)構(gòu)進(jìn)行分子動力學(xué)模擬,通過FoldX計算自由能以及穩(wěn)定性預(yù)測軟件I-mutant 2.0、STRUM和DynaMut的聯(lián)合預(yù)測對突變體進(jìn)行篩選。再進(jìn)一步通過實(shí)驗驗證獲得了魯棒性增強(qiáng)的T1脂肪酶突變體,使T1脂肪酶能更好地適應(yīng)工業(yè)生產(chǎn)的需求。主要研究內(nèi)容如下:（1）在不同壓力下（1Bar,100Bar,500Bar,1000Bar,2000Bar,4000Bar）對T1脂肪酶進(jìn)行分子動力學(xué)模擬,通過計算B-Factor、RMSD、RMSF和Rg值分析脂肪酶結(jié)構(gòu)的變化趨勢,確定與脂肪酶功能密切相關(guān)的關(guān)鍵區(qū)域為蓋子結(jié)構(gòu)域的a6螺旋。對該區(qū)域的氨基酸進(jìn)行虛擬飽和突變,通過FoldX選擇自由能變化小于0的突變體,構(gòu)建突變體庫。再使用I-mutant 2.0、... 

【文章頁數(shù)】：63 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 緒論
    1.1 脂肪酶概述
        1.1.1 脂肪酶簡介
        1.1.2 脂肪酶的應(yīng)用
        1.1.3 脂肪酶魯棒性研究進(jìn)展
        1.1.4 脂肪酶壓力耐受機(jī)制
    1.2 酶的分子改造策略及研究進(jìn)展
        1.2.1 定向進(jìn)化
        1.2.2 理性設(shè)計
        1.2.3 半理性設(shè)計
    1.3 T1脂肪酶概述
        1.3.1 T1脂肪酶來源及理化性質(zhì)
        1.3.2 T1脂肪酶結(jié)構(gòu)及催化機(jī)理
        1.3.3 T1脂肪酶的應(yīng)用價值
        1.3.4 T1脂肪酶的分子改造研究進(jìn)展
    1.4 論文的立題依據(jù)和主要研究內(nèi)容
        1.4.1 立題依據(jù)
        1.4.2 主要研究內(nèi)容
第二章 材料與方法
    2.1 實(shí)驗材料
        2.1.1 模擬與分析軟件
        2.1.2 菌株與質(zhì)粒
        2.1.3 主要試劑
        2.1.4 主要儀器
        2.1.5 主要培養(yǎng)基與溶液
    2.2 高魯棒性陽性突變體的虛擬篩選
        2.2.1 基于高壓模擬的T1脂肪酶魯棒性進(jìn)化原理
        2.2.2 基于高壓模擬的T1脂肪酶強(qiáng)魯棒性區(qū)域的篩選
        2.2.3 基于多個預(yù)測軟件的突變體聯(lián)合篩選
    2.3 突變體的構(gòu)建與篩選
        2.3.1 重組質(zhì)粒pET28a-T1載體的構(gòu)建
        2.3.2 感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化
        2.3.3 重組質(zhì)粒陽性克隆的篩選與鑒定
        2.3.4 單點(diǎn)突變體重組質(zhì)粒的構(gòu)建
        2.3.5 復(fù)合突變體重組質(zhì)粒的構(gòu)建
    2.4 野生型及突變體T1脂肪酶的分離純化和活力檢測
        2.4.1 脂肪酶的誘導(dǎo)表達(dá)
        2.4.2 脂肪酶的分離純化
        2.4.3 蛋白質(zhì)濃度的測定
        2.4.4 對硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線制作
        2.4.5 脂肪酶的酶活測定
    2.5 野生型及突變體T1脂肪酶酶學(xué)性質(zhì)測定
        2.5.1 動力學(xué)參數(shù)測定
        2.5.2 圓二色譜分析
        2.5.3 最適溫度及穩(wěn)定度穩(wěn)定性測定
        2.5.4 最適pH和pH穩(wěn)定性測定
        2.5.5 有機(jī)溶劑及金屬離子耐受性測定
        2.5.6 底物選擇性測定
第三章 結(jié)果與討論
    3.1 高魯棒性陽性突變體的虛擬篩選
        3.1.1 T1脂肪酶高魯棒性區(qū)域及位點(diǎn)的虛擬篩選
        3.1.2 基于FoldX自由能計算的突變體篩選
        3.1.3 基于STRUM、I-mutant2.0和Dyna Mut的突變體復(fù)篩
        3.1.4 小結(jié)
    3.2 單點(diǎn)突變體酶學(xué)性質(zhì)表征
        3.2.1 重組表達(dá)載體的驗證
        3.2.2 脂肪酶的分離純化及活力測定
        3.2.3 動力學(xué)參數(shù)及圓二色譜分析
        3.2.4 溫度及pH對脂肪酶活性的影響
        3.2.5 有機(jī)溶劑及金屬離子耐受性測定
        3.2.6 底物選擇性測定
        3.2.7 小結(jié)
    3.3 復(fù)合突變體酶學(xué)性質(zhì)表征
        3.3.1 重組表達(dá)載體的驗證
        3.3.2 脂肪酶的分離純化及活力測定
        3.3.3 動力學(xué)參數(shù)及半解折疊溫度測定
        3.3.4 溫度及pH對脂肪酶活性的影響
        3.3.5 有機(jī)溶劑及金屬離子對脂肪酶活性的影響
        3.3.6 底物選擇性測定
        3.3.7 小結(jié)
主要結(jié)論與展望
    主要結(jié)論
    展望
致謝
參考文獻(xiàn)
附錄 :作者在攻讀碩士學(xué)位期間的科研成果


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]金屬離子對重組深淵滕黃單胞菌低溫α-淀粉酶LamA的活性和穩(wěn)定性影響[J]. 孫清揚(yáng),張靜靜,李冰清,王巖,張曉華.  微生物學(xué)通報. 2019(11)
[2]表面活性劑對T1脂肪酶活力的影響[J]. 唐慶蕓,王永華.  現(xiàn)代食品科技. 2017(03)
[3]固定化嗜熱嗜堿土芽孢桿菌T1脂肪酶的制備及其催化特性研究[J]. 汪璞,王方華,唐慶蕓,王永華,楊博.  現(xiàn)代食品科技. 2015(05)
[4]來源于枯草芽孢桿菌的漆酶cotA基因克隆與表達(dá)及其酶學(xué)性質(zhì)研究[J]. 余小霞,劉曉青,田健,伍寧豐.  中國農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報. 2015(01)
[5]微生物脂肪酶應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 蘭立新,肖懷秋.  安徽農(nóng)業(yè)科學(xué). 2010(14)

博士論文
[1]蓋子區(qū)域疏水氨基酸調(diào)節(jié)脂肪酶T1界面吸附和水解活力的機(jī)制研究[D]. 辛瑞璞.華南理工大學(xué) 2017

碩士論文
[1]基于復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)理論和分子動力學(xué)模擬的脂肪酶熱穩(wěn)定性的研究[D]. 張雷雨.江南大學(xué) 2017
[2]基于B-factor飽和突變法篩選熱穩(wěn)定性伯克霍爾德菌脂肪酶A突變體[D]. 邱黎清.福建師范大學(xué) 2015



本文編號：3727631