核酸酶P1是由桔青霉發(fā)酵生產(chǎn)的一種含鋅金屬酶,主要用于工業(yè)生產(chǎn)核苷酸,但國內(nèi)的核酸酶P1產(chǎn)率和純度均不高,大量的依賴進(jìn)口。本論文主要對(duì)由桔青霉發(fā)酵生產(chǎn)的核酸酶P1進(jìn)行分離純化,在此基礎(chǔ)上研究了純化后核酸酶P1的酶學(xué)特性,并進(jìn)一步對(duì)核酸酶P1作為工具酶應(yīng)用于基因工程領(lǐng)域進(jìn)行了探究。經(jīng)研究得核酸酶P1的主要分離技術(shù)為:粗酶液先進(jìn)行熱處理,硫酸銨分級(jí)沉淀,透析,再進(jìn)行葡聚糖凝膠G75過濾層析、DEAE-纖維素52離子交換層析和葡聚糖凝膠過濾層析得到核酸酶P1純酶液。經(jīng)過整個(gè)純化過程,總酶活回收率約20-30%,核酸酶P1被純化了3.05倍,通過SDS-PAGE檢測(cè)為分子量約36 kDa的單一條帶。對(duì)核酸酶P1的酶學(xué)特性研究表明,核酸酶P1的最適反應(yīng)溫度為70℃,在70℃處理1 h,酶活回收率為87%。最適的反應(yīng)緩沖體系是pH 5.4的醋酸緩沖液。低濃度Zn²⁺、Mg²⁺和Ca²⁺能輕微促進(jìn)核酸酶P1的酶活,高濃度的金屬離子對(duì)核酸酶P1具有抑制作用,Cu²⁺和Fe³⁺的抑制效果最為明顯... 

【文章頁數(shù)】：83 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第1章 文獻(xiàn)綜述
    1.1 核酸酶P1概述
        1.1.1核酸酶P1
        1.1.2 核酸酶P1的性質(zhì)
            1.1.2.1 核酸酶P1的酶解特性
            1.1.2.2 核酸酶P1的結(jié)構(gòu)
            1.1.2.3 金屬離子對(duì)核酸酶P1酶活的影響
        1.1.3 核酸酶P1的生產(chǎn)
        1.1.4 核酸酶P1的用途
    1.2 蛋白質(zhì)的分離純化
        1.2.1 蛋白質(zhì)的分離純化常用方法
            1.2.1.2 硫酸銨沉淀
            1.2.1.3 凝膠過濾層析
            1.2.1.4 離子交換層析
            1.2.1.5 親和層析
            1.2.1.6 其他層析技術(shù)
            1.2.1.7 電泳
        1.2.2 微生物酶分離純化一般過程
    1.3 工具酶
    1.4 本文研究目的和研究內(nèi)容
第2章 核酸酶P1粗酶液分析
    2.1 核酸酶P1的生產(chǎn)來源
    2.2 粗酶液的分析
        2.2.1 試劑與儀器
        2.2.2 粗酶液中核酸酶P1的酶活測(cè)定
            2.2.2.1 試劑配制
            2.2.2.2 粗酶液中核酸酶P1酶活測(cè)定
        2.2.3 粗酶液中核酸酶P1的蛋白質(zhì)含量測(cè)定
        2.2.4 粗酶液中蛋白質(zhì)大小檢測(cè)
            2.2.4.1 試劑配制
            2.2.4.2 SDS-PAGE的制作
    2.3 結(jié)果與討論
    2.4 本章小結(jié)
第3章 核酸酶P1的分離純化
    3.1 引言
    3.2 材料與方法
        3.2.1 試劑與儀器
        3.2.2 粗酶液的熱處理
        3.2.3 硫酸銨分級(jí)沉淀
        3.2.4 透析
        3.2.5 葡聚糖凝膠過濾層析
        3.2.6 DEAE-纖維素52陰離子交換層析
        3.2.7 SDS-PAGE檢測(cè)核酸酶P1 的純度
    3.3 結(jié)果與討論
        3.3.1 熱處理實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.3.2 硫酸銨分級(jí)實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.3.3 SDS-PAGE檢測(cè)初步純化結(jié)果
        3.3.4 葡聚糖凝膠過濾結(jié)果
        3.3.5 DEAE-纖維素52離子交換層析實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.3.6 葡聚糖凝膠過濾層析實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.3.7 SDS-PAGE檢測(cè)層析后樣品純度
    3.4 本章小結(jié)
第4章 核酸酶P1的酶學(xué)特性
    4.1 引言
    4.2 材料與方法
        4.2.1 實(shí)驗(yàn)所需試劑及儀器
        4.2.2 核酸酶P1的最適反應(yīng)溫度
        4.2.3 核酸酶P1反應(yīng)的最適pH和pH體系
        4.2.4 金屬離子對(duì)核酸酶P1酶活性的影響
        4.2.5 核酸酶P1的動(dòng)力學(xué)參數(shù)
    4.3 結(jié)果與討論
        4.3.1 最適反應(yīng)溫度
        4.3.2 最適反應(yīng)pH及緩沖體系
        4.3.3 金屬離子和有機(jī)試劑對(duì)核酸酶P1酶活的影響
        4.3.4 動(dòng)力學(xué)模擬實(shí)驗(yàn)結(jié)果
    4.4 本章小結(jié)
第5章 核酸酶P1的應(yīng)用研究
    5.1 引言
    5.2 材料與方法
        5.2.1 儀器與試劑
        5.2.2 提高核酸酶P1的保存穩(wěn)定研究
        5.2.3 核酸酶P1的應(yīng)用研究
    5.3 結(jié)果與討論
    5.4 本章小結(jié)
第6章 結(jié)論與展望
    6.1 結(jié)論
    6.2 展望
致謝
參考文獻(xiàn)
附錄1 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的論文
附錄2 攻讀碩士學(xué)位期間參加的科研項(xiàng)目


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]黑曲霉C2J6脂肪酶的保存穩(wěn)定性研究[J]. 蘇雪林,董佩娜,萬銀松,劉婭.  中國釀造. 2018(06)
[2]桔青霉產(chǎn)核酸酶P1菌種高效選育方法研究[J]. 鄭美娟,郭金玲,田毅紅,雷生姣,呂育財(cái),余華順,姚鵑,王棟,龔大春.  化學(xué)與生物工程. 2018(02)
[3]添加劑提高酶穩(wěn)定性研究進(jìn)展[J]. 王亞軍,曹塊.  發(fā)酵科技通訊. 2016(03)
[4]酶分子穩(wěn)定性改造研究進(jìn)展[J]. 馮旭東,呂波,李春.  化工學(xué)報(bào). 2016(01)
[5]TB-DNA平板高效篩選桔青霉核酸酶P1產(chǎn)量突變株[J]. 梁新樂,孫雋,張虹,陳敏.  中國食品學(xué)報(bào). 2012(09)
[6]桔青霉高產(chǎn)核酸酶P1的固態(tài)發(fā)酵條件研究[J]. 龐宗文,李才,丁猛,馮旄,徐勇,梁靜娟,劉洋.  現(xiàn)代食品科技. 2012(07)
[7]核酸水解酶及酶解法生產(chǎn)核苷酸研究進(jìn)展[J]. 何義進(jìn),華洵璐,匡群,史濟(jì)筠,鄒三元,張一平.  遼寧大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版). 2012(02)
[8]響應(yīng)面法優(yōu)化桔青霉產(chǎn)核酸酶P1培養(yǎng)基[J]. 田呂明,葉煒,趙劫,朱昌雄,楊海珍,李沛,姚鵑,龔大春.  食品科技. 2011(10)
[9]響應(yīng)面法優(yōu)化桔青霉產(chǎn)核酸酶P1培養(yǎng)基[J]. 喻晨,張亞雄,趙劼,朱昌雄,楊海珍,姚鵑.  食品科學(xué). 2011(17)
[10]響應(yīng)面法優(yōu)化桔青霉F-5-5核酸酶P1發(fā)酵培養(yǎng)基碳氮源[J]. 梁新樂,黃瑩瑩,張虹,陳敏,劉璇.  核農(nóng)學(xué)報(bào). 2011(01)

碩士論文
[1]桔青霉來源的核酸酶P1在黑曲霉系統(tǒng)中的重組表達(dá)研究[D]. 陳筱儀.華南理工大學(xué) 2019
[2]核酸酶P1在大腸桿菌和畢赤酵母中的表達(dá)、純化及活性分析[D]. 王亞楠.西北農(nóng)林科技大學(xué) 2012
[3]產(chǎn)核酸酶P1菌株的誘變選育及發(fā)酵動(dòng)力學(xué)研究[D]. 廖明義.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2011
[4]酶法水解DNA制備5’-脫氧核甘酸的研究[D]. 吳永宏.南京工業(yè)大學(xué) 2005



本文編號(hào)：3721493