谷氨酸棒狀桿菌（Corynebacterium glutamicum,C.glutamicum）是一種重要的工業(yè)生產(chǎn)菌株,廣泛應(yīng)用于氨基酸、有機(jī)酸、藥用蛋白等產(chǎn)品的大規(guī)模生產(chǎn)。在C.glutamicum工業(yè)化好氧發(fā)酵過程中,溶氧（dissolved oxygen,DO）是一個重要的控制參數(shù),影響著目的產(chǎn)物的產(chǎn)量和質(zhì)量。然而目前針對溶氧的研究主要在于控制策略的優(yōu)化,對于溶氧響應(yīng)機(jī)制的研究尚不清晰。本研究發(fā)現(xiàn)PhoPR雙組分系統(tǒng)（two-component system,TCS）在C.glutamicum中能夠響應(yīng)溶氧水平變化,并以此對PhoPR TCS響應(yīng)外界溶氧變化的規(guī)律和功能機(jī)制進(jìn)行了研究。通過分析不同溶氧條件下C.glutamicum胞內(nèi)基因的轉(zhuǎn)錄水平變化,發(fā)現(xiàn)PhoPR為C.glutamicum在不同溶氧水平下轉(zhuǎn)錄變化最明顯的TCS。通過融合表達(dá)PhoPR啟動子區(qū)和gfp基因,發(fā)現(xiàn)融合表達(dá)菌株在不同氧氣濃度（正常氧、微需氧、無氧）環(huán)境下顯示出不同的綠色熒光強(qiáng)度,且低氧環(huán)境下菌株的熒光水平更高,確定C.glutamicum中的PhoPR TCS能夠感應(yīng)環(huán)境中的氧氣變化。通過實(shí)時熒光... 

【文章頁數(shù)】：58 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略詞表
第一章 緒論
    1.1 谷氨酸棒狀桿菌的工業(yè)發(fā)酵應(yīng)用
        1.1.1 谷氨酸棒狀桿菌的工業(yè)應(yīng)用
        1.1.2 工業(yè)發(fā)酵中的溶氧控制
    1.2 原核及真核細(xì)胞中氧氣響應(yīng)機(jī)制的研究
    1.3 雙組分系統(tǒng)及其研究進(jìn)展
        1.3.1 雙組分系統(tǒng)簡介
        1.3.2 TCS響應(yīng)氧氣變化并參與氧化應(yīng)激響應(yīng)的研究
        1.3.3 不同菌株中PhoPR TCS的功能研究
    1.4 C.glutamicum的胞內(nèi)能量代謝調(diào)控
        1.4.1 C.glutamicum中的能量代謝轉(zhuǎn)錄調(diào)控
        1.4.2 C.glutamicum中的能量代謝途徑
        1.4.3 C.glutamicum中的電子傳遞鏈
    1.5 課題研究內(nèi)容
        1.5.1 課題來源和意義
        1.5.2 本課題的主要研究內(nèi)容
第二章 實(shí)驗(yàn)材料與方法
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 菌株、質(zhì)粒和引物
        2.1.2 培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件
        2.1.3 主要溶液的配制
        2.1.4 主要試劑、試劑盒和耗材
        2.1.5 主要儀器設(shè)備
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 熱擊法轉(zhuǎn)化E.coli感受態(tài)細(xì)胞
        2.2.2 電擊法轉(zhuǎn)化C.glutamicum感受態(tài)細(xì)胞
        2.2.3 轉(zhuǎn)錄組及PhoPR基因分析
        2.2.4 融合PhoPR基因啟動子區(qū)的gfp基因表達(dá)載體的構(gòu)建
        2.2.5 不同溶氧條件下C.glutamicum的綠色熒光強(qiáng)度鑒定
        2.2.6 PhoPR TCS的生物信息學(xué)分析
        2.2.7 PhoPR敲除及過表達(dá)菌株的構(gòu)建
        2.2.8 C.glutamicum不同菌株RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄
        2.2.9 RT-qPCR分析目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄水平
        2.2.10 PhoP蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建
        2.2.11 PhoP蛋白的表達(dá)和純化
        2.2.12 SDS-PAGE分析PhoP蛋白的表達(dá)和純化結(jié)果
        2.2.13 EMSA實(shí)驗(yàn)分析PhoP蛋白與目標(biāo)基因之間的相互作用關(guān)系
        2.2.14 效應(yīng)蛋白PhoP的保守結(jié)合序列分析預(yù)測
        2.2.15 C.glutamicum不同菌株中NAD+/NADH的檢測
        2.2.16 C.glutamicum不同菌株的生長曲線及胞內(nèi)ATP測定
第三章 結(jié)果與討論
    3.1 PhoPR TCS響應(yīng)外界溶氧變化的規(guī)律探究
        3.1.1 不同溶氧條件下C.glutamicum中 TCS的轉(zhuǎn)錄水平變化
        3.1.2 不同溶氧條件下PhoPR啟動子區(qū)融合GFP蛋白的熒光強(qiáng)度比較
    3.2 PhoPR TCS的生物信息學(xué)分析
        3.2.1 PhoPR TCS的基因結(jié)構(gòu)分析
        3.2.2 不同物種中PhoP蛋白的系統(tǒng)發(fā)育分析
    3.3 PhoPR TCS在 C.glutamicum中的調(diào)控規(guī)律研究
        3.3.1 PhoPR TCS敲除和過表達(dá)菌株的構(gòu)建
        3.3.2 PhoP蛋白的表達(dá)和純化
        3.3.3 PhoPR TCS與 C.glutamicum中轉(zhuǎn)錄因子之間的調(diào)控規(guī)律研究
        3.3.4 PhoPR TCS對 C.glutamicum中能量代謝的調(diào)控規(guī)律研究
        3.3.5 PhoPR TCS對 C.glutamicum中電子傳遞鏈基因的調(diào)控規(guī)律研究
        3.3.6 PhoPR TCS對 C.glutamicum中細(xì)胞膜相關(guān)基因的調(diào)控規(guī)律研究
        3.3.7 效應(yīng)蛋白PhoP的保守結(jié)合序列分析預(yù)測
    3.4 PhoPR TCS對 C.glutamicum細(xì)胞生理特性的影響
        3.4.1 PhoPR TCS對胞內(nèi)NAD+/NADH水平的影響
        3.4.2 PhoPR TCS對細(xì)胞生長及胞內(nèi)ATP水平的影響
    3.5 C.glutamicum中 PhoPR TCS應(yīng)對外界低溶氧環(huán)境的調(diào)控機(jī)制分析
主要結(jié)論與展望
    主要結(jié)論
    展望
致謝
參考文獻(xiàn)
附錄 :作者在攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的論文
附表:本研究所用引物


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]微生物發(fā)酵中溶氧濃度的控制研究[J]. 李昶志,潘忠成,翁婧,李蒲民.  綠色科技. 2019(06)
[2]遺傳算法優(yōu)化CGXⅡ培養(yǎng)基提高谷氨酸棒狀桿菌產(chǎn)L-精氨酸[J]. 王震,張豪,鄭穗平.  中國釀造. 2019(03)
[3]代謝工程改造谷氨酸棒狀桿菌合成及分泌途徑生產(chǎn)L-纈氨酸[J]. 張海靈,李顏顏,王小元.  生物工程學(xué)報. 2018(10)
[4]谷氨酸棒狀桿菌高效發(fā)酵谷氨酸的關(guān)鍵分子機(jī)理研究進(jìn)展[J]. 楊陽,張苗苗,高越,郭曉鵬,李文建,冷非凡,陸棟.  食品工業(yè)科技. 2019(05)
[5]Sigma因子高效調(diào)控微生物多功能研究進(jìn)展[J]. 胡莉,譚澤文,郜晨,譚習(xí)羽,譚志遠(yuǎn).  生命科學(xué). 2018(03)
[6]敲除aceA和gogat及過表達(dá)gltA對谷氨酸棒狀桿菌GKGD合成α-酮戊二酸的影響[J]. 薛寧,李智祥,戰(zhàn)俊杰,趙磊,梁云龍,馮甲,劉濤,徐慶陽,張成林,陳寧.  食品與發(fā)酵工業(yè). 2017(08)
[7]原核生物RNA聚合酶輔助因子σ因子的研究進(jìn)展[J]. 徐江濤,劉曉青,田健,伍寧豐.  中國農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報. 2017(01)
[8]全局調(diào)控因子Lrp的表達(dá)強(qiáng)化谷氨酸棒狀桿菌發(fā)酵生產(chǎn)L-纈氨酸[J]. 陳誠,李顏顏,尹良鴻,胡瑾瑜,王小元.  食品與生物技術(shù)學(xué)報. 2016(09)
[9]微生物發(fā)酵過程中溶氧的影響及其調(diào)控[J]. 趙宇,陳忠敏.  食品與發(fā)酵科技. 2016(04)
[10]細(xì)菌全局性調(diào)控因子CsrA功能及其作用機(jī)制研究進(jìn)展[J]. 尚立國,戰(zhàn)崳華,弓湃,燕永亮.  中國農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報. 2014(04)

碩士論文
[1]乙醛酸循環(huán)途徑對谷氨酸棒桿菌兩階段發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的影響[D]. 王莉.浙江大學(xué) 2013



本文編號：3709864