地球上的一碳類資源有很多種,其中甲醇和甲醛作為生物代謝的基本中間產(chǎn)物之一,它們來源廣泛且廉價易得,是一種重要的底物原料。將來源于惡臭假單胞菌的苯甲酰甲酸脫羧酶進行改造,獲得了活性高的突變菌株乙醇醛合酶（Glycolaldehyde synthase,GALS）,可以催化實現(xiàn)甲醛的二聚反應(yīng),產(chǎn)物是乙醇醛,而乙醇醛是生命代謝活動的重要中間產(chǎn)物,在生物生命活動中參與多種反應(yīng),在日常生活中也有很多應(yīng)用。利用GALS設(shè)計了兩條代謝途徑,但兩個反應(yīng)過程的關(guān)鍵限制酶是GALS,因此提高GALS的酶活性,可以顯著地提高甲醛的利用效率,不僅對設(shè)計的兩條代謝途徑尤為重要,而且還為后續(xù)的研究打下基礎(chǔ)。為此,在前期研究中,實驗室通過定點突變的方式,用高通量篩選的方法,獲得了高活性的突變體。設(shè)計的第一條途徑是從甲醇出發(fā),利用甲醇脫氫酶（methanol dehydrogenase,BmMDH）、GALS和醇脫氫酶（alcohol dehydrogenase,aLdA）經(jīng)過三步催化反應(yīng)生成乙醇酸,乙醇酸可以參與生物體內(nèi)三羧酸循環(huán)等代謝途徑被生物利用。為了實現(xiàn)該途徑,首先將該過程中的關(guān)鍵酶BmMDH、GALS和aL... 

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【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
致謝
摘要
Abstract
第1章 引言
    1.1 人工生態(tài)循環(huán)
        1.1.1 生物質(zhì)新能源與地球大氣
        1.1.2 人工生態(tài)循環(huán)的設(shè)計
    1.2 生物催化途徑
        1.2.1 生物催化技術(shù)概念
        1.2.2 生物催化技術(shù)特點
        1.2.3 催化元件
        1.2.4 人工和計算機設(shè)計合成途徑
        1.2.5 生物催化與合成生物學(xué)
    1.3 一碳資源的利用
        1.3.1 二氧化碳的來源和利用
        1.3.2 甲醇的來源與利用
        1.3.3 甲醛的來源與利用
    1.4 乙醇酸
        1.4.1 乙醇酸的概述
        1.4.2 乙醇酸的性質(zhì)與應(yīng)用
        1.4.3 乙醇酸的國內(nèi)外研究進展
    1.5 木糖
        1.5.1 木糖的概述
        1.5.2 木糖的性質(zhì)與應(yīng)用
        1.5.3 木糖的國內(nèi)外研究進展
    1.6 一碳資源的研究背景
    1.7 一碳資源研究的內(nèi)容與意義
    1.8 研究的技術(shù)路線
第2章 材料與方法
    2.1 實驗材料
        2.1.1 菌種與質(zhì)粒
        2.1.2 實驗相關(guān)試劑
            2.1.2.1 常用化學(xué)試劑
            2.1.2.2 工具酶及試劑盒
        2.1.3 實驗儀器
        2.1.4 實驗相關(guān)培養(yǎng)基及緩沖液
            2.1.4.1 培養(yǎng)基及試劑
            2.1.4.2 緩沖液
            2.1.4.3 核酸膠和蛋白膠配方
    2.2 實驗方法
        2.2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建
            2.2.1.1 突變體構(gòu)建
            2.2.1.2 突變體PCR擴增
            2.2.1.3 瓊脂糖凝膠電泳檢測
            2.2.1.4 核酸膠回收
            2.2.1.5 PCR產(chǎn)物的消化
            2.2.1.6 PCR產(chǎn)物的純化
            2.2.1.7 Gibson連接
            2.2.1.8 化學(xué)轉(zhuǎn)化
            2.2.1.9 突變結(jié)果驗證
            2.2.1.10 質(zhì)粒提取方法
        2.2.2 電轉(zhuǎn)感受態(tài)細胞的制作
        2.2.3 雙質(zhì)粒共轉(zhuǎn)
    2.3 酶的功能表征方法
        2.3.1 蛋白的表達
        2.3.2 蛋白的純化
        2.3.3 SDS-PAGE檢測
        2.3.4 蛋白濃度測定
        2.3.5 酶的催化體系
        2.3.6 樣品檢測體系
            2.3.6.1 羥基乙醛檢測
            2.3.6.2 乙醇酸檢測
            2.3.6.3 稀有糖檢測
    2.4 酶的定向進化
        2.4.1 突變體構(gòu)建
        2.4.2 高通量篩選方法的確定
第3章 結(jié)果與分析
    3.1 酶的定向進化
        3.1.1 篩選步驟
        3.1.2 初篩結(jié)果
        3.1.3 復(fù)篩結(jié)果
        3.1.4 酶活表征
    3.2 甲醇到乙醇酸途徑的構(gòu)建
        3.2.1 甲醇合成乙醇酸途徑
        3.2.2 途經(jīng)相關(guān)酶的功能表征
        3.2.3 乙醇酸的體外合成
        3.2.4 體內(nèi)途徑構(gòu)建
            3.2.4.1 生長結(jié)果
            3.2.4.2 胞內(nèi)C13標記結(jié)果
    3.3 甲醛到L-木糖途徑的構(gòu)建
        3.3.1 質(zhì)粒的構(gòu)建與克隆
        3.3.2 途經(jīng)相關(guān)酶的表達與純化
        3.3.3 木糖通路的構(gòu)建
        3.3.4 酶法催化甲醛合成木糖
        3.3.5 目標產(chǎn)物木糖的檢測
        3.3.6 木糖途徑的優(yōu)化
            3.3.6.1 途徑第一步酶的確定
            3.3.6.2 途徑酶的催化效率
            3.3.6.3 底物濃度與酶比例的優(yōu)化
第4章 討論
第5章 結(jié)論與展望
    5.1 結(jié)論
    5.2 論文創(chuàng)新點
    5.3 展望
參考文獻
作者簡歷


【參考文獻】：
期刊論文
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碩士論文
[1]畢赤酵母表達體系對功能性酶的表達研究[D]. 霍辰青.北京化工大學(xué) 2014



本文編號：3707797