2-酮基-L-古龍酸（2-keto-L-gulonic acid,2-KLG）是發(fā)酵法生產(chǎn)維生素C的直接前體。山梨糖脫氫酶（Sorbose dehydrogenase,SDH）是實(shí)現(xiàn)一菌一步發(fā)酵生產(chǎn)維生素C的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)之一。在前期研究中,本實(shí)驗(yàn)獲得了一個(gè)來源于原始菌株氧化葡萄酸桿菌（Gluconobacter oxydans）WSH-004的FAD依賴的山梨糖脫氫酶,可以在不同的表達(dá)體系中實(shí)現(xiàn)活性表達(dá)。由于該山梨糖脫氫酶活性較低,如果需要利用其進(jìn)行一菌一步發(fā)酵生產(chǎn)2-KLG,需要對其酶活進(jìn)行大幅提升。本實(shí)驗(yàn)將來源于G.oxydans WSH-004的山梨糖脫氫酶在大腸桿菌（Escherichia coli）中進(jìn)行異源表達(dá),發(fā)現(xiàn)該酶在E.coli中可以直接發(fā)酵催化L-山梨糖生成2-KLG。通過優(yōu)化啟動(dòng)子、表達(dá)宿主篩選、優(yōu)化發(fā)酵溫度、敲除醛酮還原酶基因、敲除磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)（Phosphotransferase system,PTS）中的相關(guān)酶基因和通過易錯(cuò)PCR對山梨糖脫氫酶進(jìn)行隨機(jī)突變等方法,從而構(gòu)建一個(gè)適合研究山梨糖脫氫酶的高通量篩選平臺。研究結(jié)果對代謝工程改造微生物實(shí)現(xiàn)一菌一步發(fā)酵生產(chǎn)... 

【文章頁數(shù)】：50 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 緒論
    1.1 維生素C概述
    1.2 目前國內(nèi)外維生素C的研究現(xiàn)狀
        1.2.1 兩步發(fā)酵法產(chǎn)維生素C研究狀況
        1.2.2 一菌一步發(fā)酵法產(chǎn)維生素C研究狀況
    1.3 L-山梨糖到2-KLG代謝途徑中的其它相關(guān)研究進(jìn)展
        1.3.1 2-KLG到L-艾杜糖酸的代謝途徑
        1.3.2 代謝途徑中L-山梨糖參與的作用
    1.4 立體依據(jù)與研究內(nèi)容
        1.4.1 立體依據(jù)
        1.4.2 研究內(nèi)容
第二章 材料與方法
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 菌株
        2.1.2 培養(yǎng)基
        2.1.3 主要試劑
        2.1.4 主要溶液
        2.1.5 主要儀器
    2.2 分子生物學(xué)操作
        2.2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建
        2.2.2 陽性轉(zhuǎn)化子的篩選與鑒定
        2.2.3 通過CRISPR-Cas9 技術(shù)敲除E.coli中的基因
        2.2.4 質(zhì)粒的提取
        2.2.5 PCR產(chǎn)物的純化回收
        2.2.6 E.coli電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞的制備
        2.2.7 DNA片段的電轉(zhuǎn)化
        2.2.8 質(zhì)粒消除
        2.2.9 易錯(cuò)PCR
    2.3 培養(yǎng)方法
        2.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)的方法
        2.3.2 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)
        2.3.3 共表達(dá)SDH和 SNDH的培養(yǎng)
        2.3.4 MMC培養(yǎng)
        2.3.5 進(jìn)化菌株搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)
        2.3.6 發(fā)酵條件優(yōu)化
        2.3.7 發(fā)酵罐分批發(fā)酵
    2.4 純化與分析方法
        2.4.1 酶的純化
        2.4.2 菌體濃度的測定
        2.4.3 2-KLG和L-山梨糖濃度的檢測
        2.4.4 高通量篩選方法
第三章 結(jié)果與討論
    3.1 基于分子改造提高2-酮基-L-古龍酸的產(chǎn)量
        3.1.1 不同啟動(dòng)子對2-KLG產(chǎn)量的影響
        3.1.2 LC-MS鑒定目的產(chǎn)物與副產(chǎn)物
        3.1.3 篩選山梨糖脫氫酶表達(dá)宿主
        3.1.4 發(fā)酵溫度對2-KLG產(chǎn)量的影響
        3.1.5 在E.coli BL21(DE3)中共表達(dá)SDH與 SNDH
        3.1.6 搖瓶中產(chǎn)物生成及底消耗物的基本變化趨勢
        3.1.7 E.coli中醛酮還原酶基因的敲除
        3.1.8 敲除E.coli磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)中的基因
    3.2 基于微液滴馴化提高L-山梨糖的耐受性
        3.2.1 耐高濃度L-山梨糖菌株的第一輪進(jìn)化
        3.2.2 耐高濃度L-山梨糖菌株的第二輪進(jìn)化
        3.2.3 進(jìn)化菌株在搖瓶中的生長狀況
        3.2.4 搖瓶發(fā)酵條件的優(yōu)化
        3.2.5 不同底物濃度對2-KLG產(chǎn)量的影響
        3.2.6 L-山梨糖和2-KLG對菌體生長的影響
        3.2.7 5L罐上高密度發(fā)酵2-KLG的產(chǎn)量
    3.3 基于易錯(cuò)PCR篩選高產(chǎn)2-KLG的菌株
        3.3.1 2-KLG檢測范圍的確定
        3.3.2 多孔板高通量初篩體系
        3.3.3 搖瓶復(fù)篩
        3.3.4 山梨糖脫氫酶分段模塊研究
        3.3.5 基于DS模擬的定點(diǎn)突變
結(jié)論與展望
    主要結(jié)論
    展望
致謝
參考文獻(xiàn)
附錄 :作者在攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的論文


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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本文編號：3706274