萜類化合物在食品、醫(yī)藥和保健品等領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用。利用代謝工程技術(shù)異源合成各種萜類化合物是近年來的研究熱點(diǎn)。倍半萜類化合物橙花叔醇是香料和精油中的重要成分,亦被應(yīng)用于醫(yī)藥合成。在實(shí)驗(yàn)室前期基于二次生長-誘導(dǎo)系統(tǒng)構(gòu)建的橙花叔醇合成菌的基礎(chǔ)上,本論文對進(jìn)一步提高釀酒酵母橙花叔醇產(chǎn)量進(jìn)行了研究。根據(jù)以往研究報(bào)道,將轉(zhuǎn)錄因子Hac1、人細(xì)胞抗凋亡因子Bcl-2、還原型谷胱甘肽合酶Gsh1、分子伴侶Gros2、熱應(yīng)激蛋白Hsp104和Hap1六種不同的候選萜類合成促進(jìn)因子的編碼基因,分別在甲羥戊酸途徑增強(qiáng)宿主菌YS037中進(jìn)行過表達(dá),測試他們對橙花叔醇合成的促進(jìn)作用。結(jié)果表明,HAC1和BCL-2的過表達(dá)分別將橙花叔醇搖瓶產(chǎn)量提高了47.7%和77.7%。對所構(gòu)建的一系列甲羥戊酸途徑增強(qiáng)菌株的HAC1 m RNA水平進(jìn)行了測定,發(fā)現(xiàn)所構(gòu)建的菌株中發(fā)生了未折疊蛋白反應(yīng),而且他們的GAL1啟動子的轉(zhuǎn)錄受到了抑制。過表達(dá)HAC1的菌株YS038在搖瓶發(fā)酵72 h后GAL1啟動子轉(zhuǎn)錄活性提高了8.18倍,96 h后橙花叔醇產(chǎn)量提高47.7%,達(dá)到497 mg/L。過表達(dá)BCL-2的菌株YS039在發(fā)酵7... 

【文章來源】：浙江工業(yè)大學(xué)浙江省

【文章頁數(shù)】：95 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第一章 緒論
    1.1 萜類化合物簡介
    1.2 萜類化合物的應(yīng)用
    1.3 萜類化合物的生產(chǎn)方法
        1.3.1 天然提取和化學(xué)法合成萜類化合物
        1.3.2 代謝工程方法生物合成萜類化合物
    1.4 酵母細(xì)胞工廠對脅迫的耐受性
        1.4.1 高乙醇濃度
        1.4.2 高溫與高滲透壓
        1.4.3 代謝毒性
        1.4.4 蛋白質(zhì)壓力
        1.4.5 氧脅迫作用
    1.5 本課題的研究內(nèi)容及意義
第二章 酵母工程菌萜類物質(zhì)合成促進(jìn)因子的篩選
    2.1 前言
    2.2 試驗(yàn)設(shè)備與材料
        2.2.1 儀器設(shè)備
        2.2.2 質(zhì)粒菌株
        2.2.3 試劑與引物
        2.2.4 生化試劑與培養(yǎng)基配方
    2.3 實(shí)驗(yàn)方法
        2.3.1 分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)操作方法
        2.3.2 釀酒酵母感受態(tài)制備及轉(zhuǎn)化
        2.3.3 不同候選促進(jìn)因子表達(dá)載體的構(gòu)建
        2.3.4 搖瓶雙相發(fā)酵與橙花叔醇測定
        2.3.5 統(tǒng)計(jì)方法
    2.4 結(jié)果與討論
        2.4.1 高表達(dá)不同候選萜類合成促進(jìn)因子的菌株構(gòu)建
        2.4.2 不同候選促進(jìn)因子對橙花叔醇合成的作用
    2.5 本章小結(jié)
第三章 過表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子Hac1提高工程酵母橙花叔醇產(chǎn)量
    3.1 前言
    3.2 試驗(yàn)設(shè)備與材料
        3.2.1 儀器設(shè)備
        3.2.2 質(zhì)粒菌株
        3.2.3 試劑與引物
        3.2.4 生化試劑與培養(yǎng)基配方
    3.3 實(shí)驗(yàn)方法
        3.3.1 分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)操作方法
        3.3.2 釀酒酵母感受態(tài)制備及轉(zhuǎn)化
        3.3.3 HAC1不同表達(dá)方式的載體構(gòu)建
        3.3.4 釀酒酵母熒光定量PCR
        3.3.5 搖瓶雙相發(fā)酵與橙花叔醇測定
        3.3.6 統(tǒng)計(jì)方法
    3.4 結(jié)果與討論
        3.4.1 HAC1 基因PCR驗(yàn)證
        3.4.2 過表達(dá)HAC1對橙花叔醇合成的作用
        3.4.3 過表達(dá)HAC1 對細(xì)胞活力、ROS的影響
        3.4.4 已構(gòu)建菌株中剪接的HAC1、GAL1和AcNES1 的轉(zhuǎn)錄水平測定
        3.4.5 過表達(dá)HAC1對Ac NES1、GAL1 轉(zhuǎn)錄水平的影響
    3.5 本章小結(jié)
第四章 Bcl-2蛋白促進(jìn)工程菌橙花叔醇合成
    4.1 前言
    4.2 試驗(yàn)設(shè)備與材料
        4.2.1 儀器設(shè)備
        4.2.2 質(zhì)粒菌株
        4.2.3 試劑與引物
        4.2.4 生化試劑與培養(yǎng)基配方
    4.3 實(shí)驗(yàn)方法
        4.3.1 分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)操作方法
        4.3.2 感受態(tài)制備及轉(zhuǎn)化
        4.3.3 BCL-2不同表達(dá)方式的載體構(gòu)建
        4.3.4 釀酒酵母熒光定量PCR及轉(zhuǎn)錄組分析
        4.3.5 搖瓶雙相發(fā)酵與橙花叔醇測定
        4.3.6 統(tǒng)計(jì)方法
    4.4 結(jié)果與討論
        4.4.1 BCL-2 基因PCR驗(yàn)證
        4.4.2 過表達(dá)BCL-2對橙花叔醇合成的作用
        4.4.3 過表達(dá)BCL-2 對細(xì)胞活力、ROS的影響
        4.4.4 過表達(dá)BCL-2對Ac NES1、GAL1、GAL4 轉(zhuǎn)錄水平的影響
        4.4.5 對過表達(dá)HAC1、BCL-2 菌株的基因轉(zhuǎn)錄組分析
    4.5 本章小結(jié)
第五章 結(jié)論與展望
    5.1 結(jié)論
    5.2 展望
參考文獻(xiàn)
附錄
致謝
作者簡介
    1 作者簡歷
    2 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文
    3 參與的科研項(xiàng)目及獲獎情況
    4 發(fā)明專利
學(xué)位論文數(shù)據(jù)集


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]高產(chǎn)橙花叔醇的酵母細(xì)胞工廠創(chuàng)建[J]. 張麗麗,馬曉琳,王冬,郁彭,黃璐琦,張學(xué)禮,戴住波.  中國中藥雜志. 2017(15)
[2]我國聚異戊二烯橡膠生產(chǎn)技術(shù)進(jìn)展及市場分析[J]. 李玉芳,伍小明.  上�；�. 2015(01)
[3]替普瑞酮合成工藝的改進(jìn)[J]. 陳海榮,胡宗琳.  中國醫(yī)藥工業(yè)雜志. 2004(08)
[4]β-胡蘿卜素的抗氧化作用與疾病預(yù)防[J]. 范曉嵐,楊軍,糜漫天,楊慧.  中國公共衛(wèi)生. 2003(04)



本文編號：3633125