來自近平滑假絲酵母（Candida parapsilosis）CCTCC M203011的（S）-羰基還原酶Ⅱ（SCRⅡ）能催化2-羥基苯乙酮（HAP）,合成（S）-苯乙二醇（PED）,但反應(yīng)需要煙酰胺類輔酶NADPH的參與。由于輔酶價(jià)格較高、穩(wěn)定性差、難以重復(fù)利用,導(dǎo)致手性催化合成成本較高,限制了其在手性催化中的應(yīng)用。本研究運(yùn)用重疊延伸PCR技術(shù),構(gòu)建了SCRⅡ、葡萄糖脫氫酶突變體Ala258Phe/GDH和木聚糖酶XYN2三個(gè)酶的共表達(dá)和融合表達(dá)體系,以實(shí)現(xiàn)輔酶循環(huán)的高效手性合成。兩種重組菌以2-羥基苯乙酮為底物,木聚糖為輔助底物,高效合成（S）-苯乙二醇,本研究成功將木聚糖代謝介導(dǎo)的輔酶再生體系引入手性合成中,為木聚糖作輔助底物促進(jìn)氧化還原酶介導(dǎo)的手性催化奠定了研究基礎(chǔ)。具體研究?jī)?nèi)容如下:（1）以pET-SCRⅡ、pET-A258F/GDH、pET-XYN2為模板,利用重疊延伸PCR方法,將SCRⅡ、A258F/GDH和XYN2基因分別通過SD-AS、GGGGS序列連接,構(gòu)建了pET-S-SD-AS-G-SD-AS-2、pET-S-SD-AS-2-SD-AS-G、pET-G-SD... 

【文章來源】：江南大學(xué)江蘇省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁(yè)數(shù)】：49 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

羰基還原酶不對(duì)稱還原催化機(jī)理Fig.1-1Asymmetricreductionmechanismofcarbonylreductase

第二章材料與方法11圖1-2多酶偶聯(lián)體系催化(S)-苯乙二醇的生物合成途徑Fig.1-2Thebiosyntheticpathwayof(S)-PEDthroughamulti-enzymecoupledsystem

江南大學(xué)碩士學(xué)位論文20第三章結(jié)果與討論3.1構(gòu)建SCRII、A258F/GDH和XYN2共表達(dá)和融合表達(dá)菌株3.1.1多基因共表達(dá)體系的構(gòu)建以載體pET-SCRII、pET-A258F/GDH和pET-XYN2為基因模板，以設(shè)計(jì)好的帶有SD-ASlinker的兩端引物，進(jìn)行PCR，擴(kuò)增出帶有SD-ASlinker的共表達(dá)基因序列的三個(gè)單基因片段，經(jīng)退火重疊連接后延伸為完整雙鏈；然后以獲得的三個(gè)完整DNA雙鏈為模板，以首尾基因片段的引物，采用重疊延伸PCR進(jìn)行擴(kuò)增，獲得共表達(dá)基因片段S-SD-AS-G-SD-AS-2、S-SD-AS-2-SD-AS-G、G-SD-AS-S-SD-AS-2和G-SD-AS-2-SD-AS-S，電泳驗(yàn)證結(jié)果如圖3-1。圖3-1重組共表達(dá)質(zhì)粒PCR驗(yàn)證Fig.3-1Identificationofrecombinantco-expressionplasmidsbyPCRamplification注：MDNAmarker,1S-SD-AS-G-SD-AS-2,2S-SD-AS-2-SD-AS-G,3G-SD-AS-S-SD-AS-2,4G-SD-AS-2-SD-AS-S利用限制性內(nèi)切酶BamHI和SacI分別對(duì)PCR共表達(dá)基因片段S-SD-AS-G-SD-AS-2、S-SD-AS-2-SD-AS-G、G-SD-AS-S-SD-AS-2和G-SD-AS-2-SD-AS-S及表達(dá)載體pET-28a進(jìn)行雙酶酶切反應(yīng)，酶切產(chǎn)物采用膠回收、柱純化進(jìn)行提純，載體pET-28a與共表達(dá)基因片段S-SD-AS-G-SD-AS-2、S-SD-AS-2-SD-AS-G、G-SD-AS-S-SD-AS-2和G-SD-AS-2-SD-AS-S以T4DNA連接酶，金屬浴16℃條件下連接16h，轉(zhuǎn)化克隆菌株E.coliJM109感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)卡那霉素抗性LB平板篩選，提取質(zhì)粒測(cè)序驗(yàn)證，測(cè)序結(jié)果比對(duì)一致，共表達(dá)重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株E.coliBL21（DE3），獲得4種重組共表達(dá)大腸桿菌菌株E.coli/pET-S-SD-AS-G-SD-AS-2、E.coli/pET-S-SD-AS-2-SD-AS-G、E.coli/pET-G-SD-AS-S-SD-AS-2、E.coli/pET-G-SD-AS-2-SD-AS-S。共表達(dá)菌株的構(gòu)建流程如圖3-2所示。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]阿瑞匹坦有關(guān)物質(zhì)的合成[J]. 王祖元,霍彩霞,鄭志兵.  國(guó)際藥學(xué)研究雜志. 2017(07)
[2]教酒鏈霉菌L1105木聚糖酶基因xynA原核表達(dá)及誘導(dǎo)產(chǎn)酶優(yōu)化[J]. 熊科,崔曉亭,高樂,李秀婷.  中國(guó)調(diào)味品. 2016(09)
[3]耐熱木聚糖酶和葡萄糖醛酸苷酶的共表達(dá)及應(yīng)用[J]. 沈藝紅,薛業(yè)敏,侯靜靜,許家興,李相前.  食品科學(xué). 2015(01)
[4](R)-、（S）-羰基還原酶在釀酒酵母中的表達(dá)和亞細(xì)胞定位[J]. 張榮珍,徐巖,王珊珊,張波濤,耿亞維.  微生物學(xué)報(bào). 2011(06)
[5]手性2-氨基-1-苯基乙醇類化合物的不對(duì)稱合成研究進(jìn)展[J]. 趙圣印.  有機(jī)化學(xué). 2007(11)

博士論文
[1]生物催化法還原酮酯和羧酸的研究[D]. 倪燕.華東理工大學(xué) 2013

碩士論文
[1]Sortase A介導(dǎo)的羰基還原酶寡聚體熱穩(wěn)定性加強(qiáng)及高效轉(zhuǎn)化手性醇[D]. 李坤鵬.江南大學(xué) 2017



本文編號(hào)：3578036