龍涎香醇是一種三環(huán)三萜化合物,是名貴天然動物香料和傳統(tǒng)中藥龍涎香中的主要成分,是龍涎香香氣的來源,同時也是發(fā)揮鎮(zhèn)痛、抗炎等藥效的活性成分。龍涎香醇一般在高端香水市場中被應用,由于其在自然界中十分難得和化學合成難度大等原因,使龍涎香醇在香水工業(yè)和醫(yī)藥方面上的應用受到了制約。目前,以鯊烯為底物,通過D377C SHC和BmeTC的兩步體外酶催化反應而生物合成龍涎香醇已經得到實現(xiàn)。大腸桿菌作為模式微生物,是良好的外源基因表達載體,同時其內源的類異戊二烯途徑（MEP途徑）也為萜類化合物的異源合成提供了分子基礎,為龍涎香醇在大腸桿菌中的異源合成提供了可能性。在本文中,首先通過CRISPR-Cas9介導的基因組編輯技術將鯊烯合酶基因erg9整合到大腸桿菌基因組上,構建出具有鯊烯合成能力的大腸桿菌工程菌,搖瓶發(fā)酵后鯊烯產量為18.43mg/L。通過引入擬南芥來源的GPP合酶,鯊烯產量提高了1.17倍,達到21.54mg/L。在大腸桿菌中構建出鯊烯合成途徑后,將D377C SHC基因和BmeTC基因連接在質粒載體上表達,并導入大腸桿菌工程菌中,得到具有完整的龍涎香醇合成途徑的大腸桿菌工程菌,實現(xiàn)龍涎香... 

【文章來源】：天津大學天津市 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：75 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

龍涎香醇的結構式Figure1-1Chemicalstructureof(+)-ambrein

50，其分子結構式如圖1-2所示，最初從鯊魚肝部中提取得到因而得名鯊烯。鯊烯是很多三萜化合物在生物合成途徑中共同的前體物質，例如具有抗腫瘤活性的白樺脂酸等五環(huán)三萜化合物、原人參二醇等四環(huán)三萜化合物[15]。圖 1-2 鯊烯的結構式Figure1-2 Chemical structure of squalene2013年，Ueda等[16]在鑒定Bacillus megaterium來源的tetraprenyl-β-curcumene環(huán)化酶（BmeTC）活性的同時，開辟出了一條以鯊烯為底物、包含兩步酶催化反應的龍涎香醇合成路徑，如圖1-3所示。定點突變酸熱脂環(huán)酸芽孢桿菌Alicyclobacillus acidocaldarius來源的鯊烯-藿烯環(huán)化酶（SHC）所得到的多個突變體中，D377C SHC是將SHC氨基酸殘基序列中第377個天冬氨酸殘基突變?yōu)榘腚装彼釟埢�，經酶催化實驗驗證，D377C SHC可以將91.8%的鯊烯底物轉化為單環(huán)化合物3-Deoxyachilleol A

在鑒定Bacillus megaterium來源的tetraprenyl-β-curcumene環(huán)化酶（BmeTC）活性的同時，開辟出了一條以鯊烯為底物、包含兩步酶催化反應的龍涎香醇合成路徑，如圖1-3所示。定點突變酸熱脂環(huán)酸芽孢桿菌Alicyclobacillus acidocaldarius來源的鯊烯-藿烯環(huán)化酶（SHC）所得到的多個突變體中，D377C SHC是將SHC氨基酸殘基序列中第377個天冬氨酸殘基突變?yōu)榘腚装彼釟埢�，經酶催化實驗驗證，D377C SHC可以將91.8%的鯊烯底物轉化為單環(huán)化合物3-Deoxyachilleol A，并伴隨著少量副產物藿烯和藿烷醇的生成[17]。3-Deoxyachilleol A六元環(huán)上的異亞甲基可能是由鯊烯分子中某個甲基的去質子化所形成的，D377C SHC酶催化反應體系的PH值為6.0，在此PH值條件下，D377C SHC酶促反應最適溫度為60℃。起初，Sato等[18]驗證了在B. megaterium菌株中篩選出的BmeTC具有環(huán)化C35萜烯的能力


本文編號：3388689