龍涎香醇是一種三環(huán)三萜化合物,是名貴天然動(dòng)物香料和傳統(tǒng)中藥龍涎香中的主要成分,是龍涎香香氣的來(lái)源,同時(shí)也是發(fā)揮鎮(zhèn)痛、抗炎等藥效的活性成分。龍涎香醇一般在高端香水市場(chǎng)中被應(yīng)用,由于其在自然界中十分難得和化學(xué)合成難度大等原因,使龍涎香醇在香水工業(yè)和醫(yī)藥方面上的應(yīng)用受到了制約。目前,以鯊烯為底物,通過(guò)D377C SHC和BmeTC的兩步體外酶催化反應(yīng)而生物合成龍涎香醇已經(jīng)得到實(shí)現(xiàn)。大腸桿菌作為模式微生物,是良好的外源基因表達(dá)載體,同時(shí)其內(nèi)源的類異戊二烯途徑（MEP途徑）也為萜類化合物的異源合成提供了分子基礎(chǔ),為龍涎香醇在大腸桿菌中的異源合成提供了可能性。在本文中,首先通過(guò)CRISPR-Cas9介導(dǎo)的基因組編輯技術(shù)將鯊烯合酶基因erg9整合到大腸桿菌基因組上,構(gòu)建出具有鯊烯合成能力的大腸桿菌工程菌,搖瓶發(fā)酵后鯊烯產(chǎn)量為18.43mg/L。通過(guò)引入擬南芥來(lái)源的GPP合酶,鯊烯產(chǎn)量提高了1.17倍,達(dá)到21.54mg/L。在大腸桿菌中構(gòu)建出鯊烯合成途徑后,將D377C SHC基因和BmeTC基因連接在質(zhì)粒載體上表達(dá),并導(dǎo)入大腸桿菌工程菌中,得到具有完整的龍涎香醇合成途徑的大腸桿菌工程菌,實(shí)現(xiàn)龍涎香... 

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【學(xué)位級(jí)別】：碩士

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龍涎香醇的結(jié)構(gòu)式Figure1-1Chemicalstructureof(+)-ambrein

50，其分子結(jié)構(gòu)式如圖1-2所示，最初從鯊魚(yú)肝部中提取得到因而得名鯊烯。鯊烯是很多三萜化合物在生物合成途徑中共同的前體物質(zhì)，例如具有抗腫瘤活性的白樺脂酸等五環(huán)三萜化合物、原人參二醇等四環(huán)三萜化合物[15]。圖 1-2 鯊烯的結(jié)構(gòu)式Figure1-2 Chemical structure of squalene2013年，Ueda等[16]在鑒定Bacillus megaterium來(lái)源的tetraprenyl-β-curcumene環(huán)化酶（BmeTC）活性的同時(shí)，開(kāi)辟出了一條以鯊烯為底物、包含兩步酶催化反應(yīng)的龍涎香醇合成路徑，如圖1-3所示。定點(diǎn)突變酸熱脂環(huán)酸芽孢桿菌Alicyclobacillus acidocaldarius來(lái)源的鯊烯-藿烯環(huán)化酶（SHC）所得到的多個(gè)突變體中，D377C SHC是將SHC氨基酸殘基序列中第377個(gè)天冬氨酸殘基突變?yōu)榘腚装彼釟埢�，�?jīng)酶催化實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，D377C SHC可以將91.8%的鯊烯底物轉(zhuǎn)化為單環(huán)化合物3-Deoxyachilleol A

在鑒定Bacillus megaterium來(lái)源的tetraprenyl-β-curcumene環(huán)化酶（BmeTC）活性的同時(shí)，開(kāi)辟出了一條以鯊烯為底物、包含兩步酶催化反應(yīng)的龍涎香醇合成路徑，如圖1-3所示。定點(diǎn)突變酸熱脂環(huán)酸芽孢桿菌Alicyclobacillus acidocaldarius來(lái)源的鯊烯-藿烯環(huán)化酶（SHC）所得到的多個(gè)突變體中，D377C SHC是將SHC氨基酸殘基序列中第377個(gè)天冬氨酸殘基突變?yōu)榘腚装彼釟埢�，�?jīng)酶催化實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，D377C SHC可以將91.8%的鯊烯底物轉(zhuǎn)化為單環(huán)化合物3-Deoxyachilleol A，并伴隨著少量副產(chǎn)物藿烯和藿烷醇的生成[17]。3-Deoxyachilleol A六元環(huán)上的異亞甲基可能是由鯊烯分子中某個(gè)甲基的去質(zhì)子化所形成的，D377C SHC酶催化反應(yīng)體系的PH值為6.0，在此PH值條件下，D377C SHC酶促反應(yīng)最適溫度為60℃。起初，Sato等[18]驗(yàn)證了在B. megaterium菌株中篩選出的BmeTC具有環(huán)化C35萜烯的能力


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