發(fā)布時(shí)間：2021-08-09 03:18

　　相對(duì)于嗜溫微生物的常溫發(fā)酵工藝,在工業(yè)生產(chǎn)中使用嗜熱微生物進(jìn)行高溫發(fā)酵生產(chǎn),具有提高生化反應(yīng)速率、降低染菌風(fēng)險(xiǎn)、減少發(fā)酵冷卻能耗等潛在優(yōu)勢(shì)。熱葡糖苷酶地芽孢桿菌的最適生長(zhǎng)溫度為60℃,生長(zhǎng)代時(shí)16分鐘,并且能夠充分利用木質(zhì)纖維素水解物,因此是高溫微生物發(fā)酵的優(yōu)秀底盤(pán)候選菌株。熱葡糖苷酶地芽孢桿菌作為生產(chǎn)菌株能夠?qū)⑵淠透邷亍⑸L(zhǎng)快速、利用廉價(jià)碳源等特性,與工業(yè)生產(chǎn)中減少冷卻水的使用、降低染菌風(fēng)險(xiǎn)、縮短發(fā)酵周期和降低發(fā)酵原輔料成本等多種需求相互契合,具有極大地開(kāi)發(fā)價(jià)值。本論文利用耐熱綠色熒光蛋白作為反篩標(biāo)記,開(kāi)發(fā)了一種快速便捷的地芽孢桿菌遺傳操作方法。使用該方法對(duì)熱葡糖苷酶地芽孢桿菌進(jìn)行代謝工程改造,實(shí)現(xiàn)了產(chǎn)量從無(wú)到有,從低到高的高溫核黃素生產(chǎn)菌株的開(kāi)發(fā)。在熱葡糖苷酶地芽孢桿菌中引入異源核黃素生物合成基因簇,獲得第一代核黃素菌株Rib-Gtd,核黃素產(chǎn)量達(dá)28.7 mg/L;對(duì)ribCGtg進(jìn)行點(diǎn)突變,獲得降低核黃素細(xì)胞消耗的第二代核黃素菌株Rib-Gtdl,核黃素產(chǎn)量達(dá)84.6mg/L;敲除嘌吟途徑的調(diào)控蛋白PurRGtg解除對(duì)嘌呤途徑的抑制,獲得第三代核黃素菌株Rib-Gtd2,核黃素... 

【文章來(lái)源】：華東理工大學(xué)上海市 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁(yè)數(shù)】：83 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

圖１．８依賴(lài)ＦＭＮ的核糖體開(kāi)關(guān)模型，六個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu)被標(biāo)記為Ｐ１－Ｐ６１３９１??Ｆｉｇ．?１．８?Ｍｏｄｅｌ?ｆｏｒ?ｔｈｅ?ＦＭＮ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ?ｒｉｂｏｓｗｉｔｃｈ，?ｔｈｅ?ｓｉｘ??

華東理工大學(xué)碩士學(xué)位論文?第１５頁(yè)??…?ｇｄｈ?ＧＩｕｃｏｎｏ－１，５－?…??Ｇ，ＵＣ〇ＳＣ????ｌａｃｔｏｎｅ????Ｇｌｕｃｏｎａｔｅ??ｐｇｉ?ｇｎｔｋ??＾?＾?ＧＩｕｃｏｎｏ－１，５－?ｙｋｇＢ??Ｇｌｕｃ〇Ｓｅ－６Ｐ?＾?ｌａｃｔｏｎｅ－６Ｐ??？?Ｇｌｕｃｏｎａｔｅ－６Ｐ??１??Ｆｒｕｃｔｏｓｅ－６Ｐ？．?＾??ｉ?＿??？??Ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙ－３Ｐ???？；?ＲｉｂｕＩｏｓｅ－５Ｐ??圖１．９枯草桿菌的氧化戊糖磷酸途徑及其相關(guān)反應(yīng)。??Ｆｉｇ．?１．９?Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ?ｐｅｎｔｏｓｅ?ｐｈｏｓｐｈａｔｅ?ｐａｔｈｗａｙ?ａｎｄ?ｒｅｌａｔｅｄ?ｒｅａｃｔｉｏｎｓ?ｏｆＳ．?ｓｕｂｔｉｌｉｓ．??１．２．１．５增加能量供應(yīng)??使用枯草芽孢桿菌生產(chǎn)核黃素的反應(yīng)方程式為３?Ｒｕ５Ｐ?＋?Ｇｌｙ?＋?１４?ＡＴＰ?＋?２Ｑ?＋??２ＮＡＤＰＨ?＋?３Ｎ?—ｒｉｂｏｆｌａｖｉｎ?＋?３ＮＡＤＨ?＋?２ｆｏｒｍａｔｅ。由反應(yīng)方程式得知，需要消耗１４分??子ＡＴＰ才能產(chǎn)生一分子核黃素，因此細(xì)胞ＡＴＰ供能不足可能是限制核黃素生產(chǎn)的重要??因素。ＡＴＰ由還原力ＮＡＤＨ產(chǎn)生，與呼吸鏈的氧化磷酸化相關(guān)。由于呼吸鏈上同時(shí)存??在能量耦合效率低的細(xì)胞色素ｂｄ氧化酶（由ｃｙｄ基因編碼）和耦合效率高的ａａ３氧化??酶，Ｚａｍｂｏｎｉ等人通過(guò)敲除ｃｙｄ基因改變呼吸鏈中的電子流向，降低ｃｙｄ缺失株的維持??能。最終使得產(chǎn)量由對(duì)照組的８．９ｇ／Ｌ提高到１２．３?ｇ／Ｌ。Ｓｉｍｏｎ?Ｔｉｎｎｉｅｒ等人通過(guò)敲除枯草??芽孢桿菌的基因后發(fā)現(xiàn)，和野生型菌株相比，敲除株的維持能下降，乙酸的含量下??降

７１＾１１１八４２６中發(fā)現(xiàn)一個(gè)受麥芽糖誘導(dǎo)的啟動(dòng)子??Ｐ＃７Ｗ（在含有ａ－淀粉酶的時(shí)候也能受直鏈淀粉誘導(dǎo)）。在基因組上表達(dá)的時(shí)，幾乎無(wú)滲??漏表達(dá)。當(dāng)放到多拷貝質(zhì)粒上時(shí)，略有滲漏。培養(yǎng)２０小時(shí)后，啟動(dòng)子強(qiáng)度相比沒(méi)有誘??導(dǎo)的對(duì)照提高６倍左右。該啟動(dòng)子受到Ｄ－木糖和Ｌ－阿拉伯糖抑制［１２３］。??Ｎｃｏ＼?ｓＷｅｆｓｕｒＰ??Ｎｓｐｌｓｉｔｅ?ＥｃｏＲ＼?ｓｉｔｅ?ｓｔａｒｔ?ｃｏｄｏｎ??．?Ｉ?ｋ?＾?ｓｕｒＡ？?ｒｅｇｉｏｎ??－Ｌ－ＰＯ?ｓｕｒＴ?￣Ｈ￣ＩＱ—Ｉ—??圖１．１２蔗糖誘導(dǎo)操縱子的調(diào)控區(qū)域ｌ１２２ｉ??Ｆｉｇ．?１．１２?Ｔｈｅ?ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ?ｒｅｇｉｏｎ?ｏｆ?ｔｈｅ?ｓｕｃｒｏｓｅ?ｉｎｄｕｃｅｄ?ｏｐｅｒｏｎ?ｉｓ?ｓｃｈｅｍａｔｉｚｅｄ！１２２＇??總的來(lái)說(shuō)，目前地芽孢桿菌雖然能夠使用同源重組方法進(jìn)行基因編輯，但是由于沒(méi)??有合適的篩選標(biāo)記，地芽孢桿菌基因編輯仍然費(fèi)時(shí)費(fèi)力，嚴(yán)重制約了地芽孢桿菌的遺傳??代謝研宄。??１．４本論文的立題依據(jù)、研宄內(nèi)容、目標(biāo)和意義??作為ＦＭＮ和ＦＡＤ的直接前體，核黃素是所有細(xì)菌、植物和動(dòng)物細(xì)胞生理必需的重??要組成部分，目前已廣泛應(yīng)用于制藥、化妝品、人體及動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)等領(lǐng)域［７］。由于核黃素??具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值，因此核黃素的需求量逐年增多，到２０１５年全球的核黃素年需求??量己達(dá)到９０００噸，而且每年有６％左右的需求增長(zhǎng)［８］。目前，核黃素化學(xué)合成法已經(jīng)完??

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]在枯草芽孢桿菌中表達(dá)B.cereus ATCC14579的異源核黃素操縱子提高核黃素產(chǎn)量（英文）[J]. 段云霞,陳濤,陳洵,王靖宇,趙學(xué)明.  Chinese Journal of Chemical Engineering. 2010(01)
[2]hprK基因敲除及對(duì)其枯草芽孢桿菌核黃素發(fā)酵的影響[J]. 張帆,宋輝,班睿.  生物工程學(xué)報(bào). 2006(04)

博士論文
[1]產(chǎn)核黃素Bacillus subtilis中心代謝途徑代謝工程和比較基因組學(xué)[D]. 王智文.天津大學(xué) 2011



本文編號(hào)：3331254