辣根過氧化物酶（HRP）是一種由無色蛋白質和棕色鐵卟啉組成的糖蛋白。目前,HRP廣泛用于污水處理、食品工業(yè)和催化反應。然而,HRP提純于植物,在純化過程中很容易失活,使其生產(chǎn)成本普遍較高。嚴重阻礙了蛋白質在工業(yè)生產(chǎn)中的應用。因此,提高蛋白質分離和純化的效率是生物工程領域的熱門話題。本課題將雙水相初步萃取法和多價苯硼酸磁性石墨烯材料進一步吸附分離相耦合應用于純化辣根過氧化物酶,并取得了良好的效果,具體工作內容如下:（1）構建17R4/L35-鹽雙水相萃取體系初步分離純化蛋白質。實驗研究了17R4/L35濃度、鹽的質量分數(shù)以及控溫沉淀中電解質、pH對蛋白質分配效率的影響。優(yōu)化實驗條件如下:聚合物選用17R4,鹽選用（NH₄）₂SO₄,萃取溫度為20℃,控溫沉淀時,加入電解質為檸檬酸三鈉、體系pH=7.0、控制溫度為30℃,此時體系的蛋白質的回收率為70-80%,取得了良好的初級分離純化的效果。在本實驗中,為了模擬辣根中未知的物質和環(huán)境,我們建立了模型實驗,研究了9種目標物（糖類、色素、蛋白質）的分配情況。調節(jié)體系pH值、改變... 

【文章來源】：江蘇大學江蘇省

【文章頁數(shù)】：80 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

HRP的二級結構示意圖[1]

35等領域的分離純化環(huán)節(jié)。早在1896年，科學家Beijerinck將一定量的明膠和瓊脂混合成溶液，發(fā)現(xiàn)了兩相分離的現(xiàn)象，稱雙水相現(xiàn)象。1956年，Albertsson通過ATPS分離純化葉綠素，開創(chuàng)了ATPS在分離純化方面的應用先河；隨后，德國的Kula等研究者們又利用ATPS對其他生物活性物質實現(xiàn)了分離純化，并取得了成功。此后，ATPE因具有水溶性好、生物相容性好、工藝流程簡單和易于分離等優(yōu)點，從而取代了傳統(tǒng)液液萃取的方法而廣泛使用，尤其適用于蛋白質36、細胞器37、抗體38、納米粒子39和其他的一些生物分子40的分離純化。圖1.2雙水相示意圖Figure1.2Schematicdiagramofaqueoustwophase1.2.1雙水相體系的分類在20世紀60年代，研究工作者研究的方向主要聚集在由聚合物-聚合物雙水相體系。由于聚合物-聚合物雙水相體系粘度大、產(chǎn)物難分離和容易破壞生物活性物質的結構。因此，聚合物-聚合物雙水相體系不適用于分離純化生物物質。為了擴大雙水相體系的應用領域，研究工作者通過不斷地試驗發(fā)現(xiàn)了更多的物質可以作為成相物質，引入到雙水相體系中。根據(jù)雙水相體系的成相物質不同，可以將體系分為以下幾種：聚合物-鹽雙水相體系、聚合物-聚合物雙水相體系、親水性有機溶劑-鹽雙水相體系、表面活性劑-表面活性劑雙水相體系和離子液體-鹽雙水相體系等，常見的成相物質如表1.1所示。由于雙水相體系的成相物質不同，它們的性質和應用領域也不同，例如：食品、生物工程、環(huán)境化學和醫(yī)療保健等領域的分離純化環(huán)節(jié)。迄今為止應用最廣泛的雙水相體系是聚合物-鹽雙水相體系，具有兩相界面張力小生物相容性好，分相速度快和綠色環(huán)保等優(yōu)點。該

江蘇大學碩士學位論文11An63等人通過表面引發(fā)的原子轉移自由基聚合(SI-ATRP)成功地合成了氧化石墨烯的聚合物刷(GO@PVPBA)，用于從復雜環(huán)境中選擇性分離純化糖蛋白。GO@PVPBA納米復合材料顯示出高表面積和出色的磁容量。同時，SI-ATRP將高密度的硼酸聚合物刷固定在GO表面�？梢詮膹碗s系統(tǒng)中選擇性富集糖蛋白-蛋白卵清蛋白(OVA)、轉鐵蛋白(Trf)，證明了GO@PVPBA納米復合材料的選擇性識別能力。此外，GO@PVPBA納米復合材料還顯示出對OVA和Trf的高結合能力，吸附量分別達到514.8和445.9mg·g-1。因此，GO@PVPBA納米復合材料在生物環(huán)境中表現(xiàn)出更高的吸收能力和對糖蛋白的良好特異性。這項工作為表面功能化磁性氧化石墨烯在復雜系統(tǒng)中選擇性分離和富集蛋白質提供了新的思路。圖1.4利用功能化磁性材料進行生物分離的流程示意圖[64]Figure1.4SchematicdiagramoftheprocessofbiologicalseparationusingfunctionalmagneticmaterialsMolday等人64采用了磁性材料分離細胞。他們運用了熒光標記了磁性微球，然后與外源凝集素以及抗體進行偶聯(lián)，選擇性磁性微球分離出紅細胞和淋巴B細胞，流程如圖1.4所示。Martinez等人將具有炔雌醇抗體的磁性材料和多壁碳納米管修飾的玻碳電極聯(lián)用，成功構建了對于水中炔雌醇具有高選擇性的高靈敏生物分離和電化學檢測方法，最低定量限為0.01ng/L，相對標準偏差<4.20%65。Anja等人利用了疏水烷基胺磁性材料實現(xiàn)了分離純化蛋白質以及酶的轉化，分離純化效率高達87%以上66。相比與傳統(tǒng)的細胞分離技術，磁性分離在外加磁場

【參考文獻】：
期刊論文
[1]微乳液中酶催化木素-酚共聚物的性能研究[J]. 邱龍輝,黃開勛,李良智,史大永,周遠明,劉均洪.  青島化工學院學報(自然科學版). 2001(02)
[2]酶促木素與酚共聚反應速率的研究[J]. 劉均洪,葉林,邱龍輝,咸漠,孫巖,袁衛(wèi)平.  石化技術與應用. 2000(05)
[3]N-甲基吩嗪為介體辣根過氧化物酶傳感器的研究[J]. 王朝瑾,應太林,吳芯芯,漆德瑤.  生物化學與生物物理學報. 1998(06)
[4]過氧化物酶催化酚聚合的研究[J]. 許海燕,徐梁華,龐正智.  功能高分子學報. 1995(03)



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