聚羥基脂肪酸酯（Polyhydroxyalkanoates,PHA）是多種微生物在碳源過剩、氮源受限時(shí)合成的一種天然高分子材料,因其具有材料多變性、熱塑性、生物可降解性、生物相容性等特點(diǎn),在塑料包裝、化工、生物醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)、生物能源等領(lǐng)域的具有很大的應(yīng)用前景。目前PHA生產(chǎn)成本高、生產(chǎn)效率低下、發(fā)酵中粒徑不易控制等原因,限制了天然PHA顆粒的研發(fā)與應(yīng)用。因此,低成本的粒徑可控的天然PHA顆粒的生產(chǎn)和加工是目前研究的熱點(diǎn)。本課題基于前期成功鑒定的嗜鹽古菌Haloferax mediterranei中PHA結(jié)合的結(jié)構(gòu)蛋白PhaP和PHA調(diào)控蛋白PhaR,通過調(diào)整PhaP或PhaR等PHA顆粒相關(guān)蛋白表達(dá)量,或更換PHA生產(chǎn)的背景菌株等方法,影響PHA顆粒的粒徑,并總結(jié)出一套PHA顆粒粒徑控制策略:在PhaP蛋白高量過表達(dá)的H.mediterraneiDF50::pWLoxP、H.mediterraneiΔphaRP::pWLoxP及H.mediterraneiΔphaRP::pWLexP組中,主要生產(chǎn)100nm以下的小粒徑PHA顆粒;在PhaP中度過表達(dá)的H.mediterraneiDF50... 

【文章來源】：華僑大學(xué)福建省

【文章頁數(shù)】：73 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

PHA分子結(jié)構(gòu)通式

13第2章材料與方法2.1相關(guān)材料2.1.1菌種本研究選擇TIANGEN公司的大腸桿菌E.coliTOP10用于分子克攏H.mediterraneiCGMCC1.2087為本研究采用的野生型地中海富鹽菌菌株，H.mediterraneiDF50為基于野生型地中海富鹽菌的尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型菌株，H.mediterraneiΔphaRP為基于H.mediterraneiDF50的phaR&phaP雙敲除株。2.1.2質(zhì)粒本研究選擇pWL502質(zhì)粒作為載體，質(zhì)粒圖譜如圖2.1所示。本課題選用pWL502質(zhì)粒作為分子克隆操作的載體，pWL502質(zhì)粒是一種穿梭質(zhì)粒，不僅可以在大腸桿菌中復(fù)制擴(kuò)增，也可以在嗜鹽古菌中擴(kuò)增和表達(dá)。圖2.1pWL502質(zhì)粒圖譜pWL502質(zhì)粒全長約7.9kb，含有多種復(fù)制起始位點(diǎn)，pWL502質(zhì)粒含有BamHⅠ、KpnⅠ等多種限制性酶切位點(diǎn)，可進(jìn)行酶切，連接來插入外源DNA片段。pWL502質(zhì)粒含有氨芐青霉素抗性基因，含pWL502質(zhì)粒的大腸桿菌可在含

19（66bp）片段，在設(shè)計(jì)引物時(shí)，在兩種啟動子的上游引入酶切位點(diǎn)KpnⅠ，下游引入酶切位點(diǎn)HindⅢ。圖2.2pWLexP質(zhì)粒構(gòu)建示意圖為獲得片段gfp（726），我們以質(zhì)粒pWLGFP為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增得到，并在設(shè)計(jì)引物時(shí)，在片段上游引入酶切位點(diǎn)HindⅢ，下游引入酶切位點(diǎn)BamHⅠ。為獲得片段phaP(468bp)，我們同樣以H.mediterraneiATCC33500裂解液作模板，經(jīng)過PCR擴(kuò)增得到，并在設(shè)計(jì)引物時(shí)，在phaP上游引入酶切位點(diǎn)HindⅢ，下游引入酶切位點(diǎn)BamHⅠ。為獲得片段ex-Pro-gfp和片段ox-Pro-gfp，將片段ex-Pro、ox-Pro和gfp經(jīng)HindⅢ酶切孵育后，經(jīng)T4DNA連接酶連接即分別得到片段ex-Pro-gfp(894bp)和ox-Pro-gfp(792bp)。為獲得片段ex-Pro-phaP和片段ox-Pro-phaP，將片段ex-Pro、ox-Pro和phaP經(jīng)HindⅢ酶切孵育后，經(jīng)T4DNA連接酶連接即分別得到片段ex-Pro-phaP(636bp)和ox-Pro-phaP(534bp)。由于H.mediterranei的基因組內(nèi)，啟動子WTpRF（后66bp即為啟動子D41）和phaR片段直接相連，因此片段ex-pro-phaR(489bp)和片段ox-pro-phaR(387bp)可直接以H.mediterranei裂解液為模板經(jīng)pcr得到。在設(shè)計(jì)引物時(shí)，在片段首尾分別添加酶切位點(diǎn)KpnⅠ和酶切位點(diǎn)BamHⅠ。

【參考文獻(xiàn)】：
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本文編號：3301952