脂肪酸廣泛應(yīng)用于工業(yè)領(lǐng)域,尤其是不飽和長鏈脂肪酸對人體健康具有重要的作用。天然油脂含有大量的長鏈脂肪酸,酶水解法由于環(huán)境友好、設(shè)備簡單和特異性等優(yōu)勢成為脂肪酸制備的主要方法。然而,對中鏈脂肪酸水解特異性較強的華根霉脂肪酶（Rhizopus chinensis lipase,RCL）,水解不飽和長鏈脂肪酸含量較高的天然油脂能力較弱,難以達到脂肪酸工業(yè)生產(chǎn)的水平。目前,關(guān)于酶的不飽和脂肪酸特異性改造研究較少,本文通過理性設(shè)計華根霉脂肪酶獲得了對不飽和長鏈脂肪酸特異性增強的突變酶,該突變酶催化大豆油水解的能力相應(yīng)地提高。最后采用介孔氧化硅固定化脂肪酶,初步研究了固定化脂肪酶在大豆油水解中的重復(fù)使用穩(wěn)定性。具體內(nèi)容包括:（1）針對華根霉脂肪酶的底物結(jié)合口袋理性設(shè)計了6個突變位點,利用全質(zhì)粒PCR技術(shù)獲得了突變酶L285Q、T286Q、HQL、A116W、I281F和A116W/I281F,并成功地在畢赤酵母中獲得了表達。重組畢赤酵母工程菌GS115/pPIC9K-RCLHQL的生長趨勢與原始菌株相似。（2）考察了突變酶的底物特異性和酶學(xué)性質(zhì),突變酶HQL增強了對不飽和長鏈脂肪酸的特異性,對pN... 

【文章來源】：江南大學(xué)江蘇省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：46 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

不同脂肪酶結(jié)構(gòu)示意圖

圖 2-1 重組質(zhì)粒 pPIC9K-RCL 構(gòu)建圖譜. 2-1 Construction of cloning plasmid pPIC9K-）：10.00 g 胰蛋白胨，5.00 g 酵母提取物養(yǎng)基時加入 20.00 g 瓊脂粉。1L）：20.00 g 胰蛋白胨，10.00 g 酵母提固體培養(yǎng)基時加入 20.00 g 瓊脂粉。L）：13.40 g YNB，4×10-4g 生物素，20 min。）: 20.00 g 胰蛋白胨，10.00 g 酵母提取.0 磷酸鉀緩沖液，13.40 g YNB，4×10）: 20.00 g 胰蛋白胨，10.00 g 酵母提取.0 磷酸鉀緩沖液，13.40 g YNB，4×1

酶底物結(jié)合口袋中氨基酸的親疏水性以及側(cè)鏈基團大小等因素可能會影響脂肪酶的底物特異性。因此，根據(jù)華根霉脂肪酶（RCL）晶體結(jié)構(gòu)分析和多序列同源比對，針對 RCL 底物結(jié)合口袋設(shè)計突變位點，從增加口袋親水性的角度設(shè)計三個突變體，包括L285Q、T286Q 以及在序列 H284 和 L285 中間插入一個親水氨基酸谷氨酰胺 Q，突變體命名為 HQL；從增加空間位阻的角度設(shè)計三個突變位點，包括 A116W、I281F 和A116W/I281F。由圖 3-1(a)可知，S172、D231 和 H284 為脂肪酶催化三聯(lián)體，“蓋子”結(jié)構(gòu)位于脂肪酶活性中心的上方， A116 位于“蓋子”結(jié)構(gòu)上，I281、L285 和 T286 位于底物結(jié)合口袋附近。突變后模擬結(jié)構(gòu)如圖 3-1(b)所示，蓋子結(jié)構(gòu)上 116 位的 A（丙氨酸）突變?yōu)?W（色氨酸）后，引入了一個雜環(huán)基團；底物結(jié)合口袋附近 281 位的 I（異亮氨酸）突變?yōu)?F（苯丙氨酸）后，引入了一個苯環(huán)基團；這兩者均增加了空間位阻。底物結(jié)合口袋附近 285 位的 L（亮氨酸）、286 位的 T（蘇氨酸）突變?yōu)?Q（谷氨酰胺）后，以及在 284 位的 H（組氨酸）與 285 位的 L 之間插入一個 Q 后，均增加了底物結(jié)合口袋的親水性。RCL 氨基酸序列中共有 398 個氨基酸殘基，包括 26 個氨基酸的信號肽序列，94 個氨基酸的前導(dǎo)肽序列和 278 個氨基酸的成熟肽序列。圖 3-2 為 RCL 氨基酸序列圖。

【參考文獻】：
期刊論文
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博士論文
[1]華根霉（Rhizopus chinensis）脂肪酶在異源宿主中的高效分泌表達[D]. 沙沖.江南大學(xué) 2015
[2]超聲作用下脂肪酶催化豆油水解反應(yīng)的研究[D]. 劉亞軒.江南大學(xué) 2008
[3]華根霉（Rhizopus chinensis）非水相合成活性脂肪酶及其酶學(xué)特性的研究[D]. 王棟.江南大學(xué) 2008

碩士論文
[1]米曲霉脯氨酰內(nèi)肽酶在畢赤酵母中的表達、酶學(xué)特性及其應(yīng)用研究[D]. 江婷.江南大學(xué) 2016
[2]脂肪酶前導(dǎo)肽及N-糖基化對酶在畢赤酵母中分泌表達及酶學(xué)特性的影響機制研究[D]. 楊敏.江南大學(xué) 2015
[3]華根霉（Rhizopus chinensis）脂肪酶底物特異性的定向改造[D]. 朱珊珊.江南大學(xué) 2012
[4]華根霉（Rhizopus chinensis）前導(dǎo)肽和成熟肽脂肪酶在E.coli中的克隆表達和酶學(xué)性質(zhì)研究[D]. 李飏.江南大學(xué) 2008
[5]華根霉（Rhizopus chinensis）脂肪酶的基因克隆、表達，純化和酶學(xué)性質(zhì)研究[D]. 王樂樂.江南大學(xué) 2008



本文編號：3297767