檀香精油是目前世界上最昂貴的香料之一,其主要成分為檀香醇。檀香烯是檀香醇的前體化合物。為實現(xiàn)檀香烯的高效生產(chǎn),本文通過對檀香烯合酶的表達調(diào)控以及內(nèi)源萜類代謝途徑的改造,利用釀酒酵母構(gòu)建高效生物合成α-檀香烯的細胞工廠。本文首先考察了釀酒酵母中CPRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的編輯效率。結(jié)果表明,利用上下游為200-500 bp的同源臂,可以對2000bp-7000 bp的目標位點進行敲除,編輯效率為100%;利用引物引入40 bp的同源區(qū),能夠高效實現(xiàn)1000-10000 bp的片段的插入。以釀酒酵母CENPK2-1C和BY4741為出發(fā)菌株,將tHMG1和ERG20表達組件分別整合至DPP1、LPP1位點來提高MVA途徑的代謝強度。通過引入外源的檀香烯合酶在酵母工程菌中構(gòu)建檀香烯的生物合成途徑,并考察了啟動子強度,宿主細胞以及表達質(zhì)�？截悢�(shù)對于α-檀香烯產(chǎn)量的影響。結(jié)果表明,以釀酒酵母SCN02為宿主細胞,以高拷貝質(zhì)粒為表達載體,以啟動子pTEF1來表達檀香烯合酶的α-檀香烯產(chǎn)量最高,達到12.7 mg/L。在此基礎上對下游的角鯊烯途徑進行了弱化,檀香烯產(chǎn)量進一步提高至24.7m... 

【文章來源】：浙江大學浙江省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：88 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖１．１甲羥戊酸（ＭＶＡ）途徑（Ａ）和２－甲基－４磷酸－４－Ｄ－赤蘚糖醇（ＭＥＰ）途徑（Ｂ）示意??

Ｆｉｇ．?１．３?Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ?ｏｆ?ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９?ｇｅｎｅ?ｅｄｉｔｉｎｇ??１．５．１?ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系統(tǒng)應用與發(fā)展??Ｄｏｕｄｎａ與Ｃｈａｒｐｅｎｔｉｅｒ兩個團隊合作對化膿鏈球菌的ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系統(tǒng)進行??改造，將?ｔｒａｃｒＲＮＡ?和?ｃｒＲＮＡ?整合為一條單鏈，稱為?ｃｒＲＮＡ：?ｔｒａｃｒＲＮＡ?ｃｈｉｍｅｒａ，??成功實現(xiàn)了體外的ＤＮＡ精確切割［６７］。張鋒課題組利用鏈球菌ＩＩ型Ｃａｓ９系統(tǒng)，??通過外源表達的單鏈向?qū)Вǎ螅椋睿纾欤澹纾酰椋洌澹?ＲＮＡ，ｓｇＲＮＡ；?ｔｒａｃｒＲＮＡ與ｃｒＲＮＡ通??過短ＲＮＡ連接在一起），可以引導Ｃａｓ９切割哺乳動物細胞基因組，并引發(fā)同源??重組修復（Ｈｏｍｏｌｏｇｙ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ?Ｒｅｐａｉｒ，ＨＤＲ?）或非同源的末端連接??（Ｎｏｎ－Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ?Ｅｎｄ?Ｊｏｉｎｉｎｇ，?ＮＨＥＪ）介導的基因組編輯［６８］利用?Ｃａｓ９ｎ?與具有??堿基修飾功能的蛋白融合可以對基因組特定位點進行單堿基突變，并且避免了雙??鏈斷裂［６９’７Ｇ］。如Ｋｏｍｏｒ等人將Ｃａｓ９ｎ與脫氨酶（Ｄｅａｍｉｎａｓｅ）和尿墻卩定糖基酶抑??２４??

圖２．１?ＤＮＡ片段制備過程（Ａ）基因敲除用的同源臂制備（Ｂ）基因插入ＤＮＡ片段制Ｆｉｇｕｒｅ?２．１?Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ?ｏｆ?ＤＮＡ?ｆｒａｇｍｅｎｔ．??．７．２釀酒酵母利用ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９進行基因編輯方法??１．將Ｃａｓ９基因表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到釀酒酵母中，轉(zhuǎn)化方法參考本章，用潮霉素篩．將ｓｇＲＮＡ質(zhì)粒和同源片段轉(zhuǎn)化到上一步轉(zhuǎn)化含有Ｃａｓ９表達質(zhì)粒的釀酒中，用潮霉素和Ｇ４１８的ＹＰＤ平板篩選，轉(zhuǎn)化后挑取轉(zhuǎn)化子驗證??．將有正確基因型的轉(zhuǎn)化子接入只含有潮霉素的５ｍｌＹＰＤ試管中培養(yǎng)１２小取ｌＯＯｕｌ轉(zhuǎn)接新鮮５ｍｌＹＰＤ試管中，添加潮霉素。連續(xù)轉(zhuǎn)接３次，稀釋１００倍后涂布于潮霉素ＹＰＤ固體平板。置于３０°Ｃ恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)２－３天。簽挑取單菌落于含有Ｇ４１８抗性的ＹＰＤ平板中，驗證ｓｇＲＮＡ丟失情況。??．ｓＲＮＡ下一。??

【參考文獻】：
期刊論文
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博士論文
[1]類胡蘿卜素高產(chǎn)菌株高效篩選及合成代謝調(diào)控研究[D]. 王紅波.華中科技大學 2014

碩士論文
[1]啟動子和載體對酵母人工細胞青蒿二烯產(chǎn)量的影響研究[D]. 王思佳.天津大學 2013
[2]青蒿二烯功能模塊與酵母底盤的適配性研究[D]. 賈云婧.天津大學 2013



本文編號：3259874