γ-氨基丁酸（GABA）是一種廣泛存在于植物、動(dòng)物和微生物體內(nèi)的非蛋白質(zhì)氨基酸,具有降血壓、抗焦慮、調(diào)節(jié)激素分泌等多種生理功能,在食品、醫(yī)藥和化工領(lǐng)域都有很重要的應(yīng)用價(jià)值。谷氨酸脫羧酶（GAD）通過(guò)脫羧作用將谷氨酸（Glu）轉(zhuǎn)化為GABA。因此,篩選高比酶活力的谷氨酸脫羧酶突變體并建立相應(yīng)的高密度發(fā)酵工藝具有重要的意義。首先,建立了谷氨酸脫羧酶突變體的高通量篩選體系。根據(jù)全細(xì)胞轉(zhuǎn)化Glu生成GABA過(guò)程中的pH變化規(guī)律,選擇氯酚紅-溴甲酚綠鈉酸堿指示劑,確立指示劑比例為1:1,篩選濃度為0.6%（v/v）,Glu底物濃度為10g/L的顯色體系,建立了抗性平板初篩,深孔板培養(yǎng)單菌落,96孔板轉(zhuǎn)化,酶標(biāo)儀OD575/OD600掃描比對(duì)分析,搖瓶復(fù)篩的高通量篩選體系。其次,獲得了Glu轉(zhuǎn)化效率提高的工程菌。通過(guò)易錯(cuò)PCR技術(shù)構(gòu)建GAD突變體文庫(kù),利用構(gòu)建的篩選體系獲得三株轉(zhuǎn)化效率提高且耐熱性改善的工程菌。菌株BW（△C）/PYB1 S-L bgadBV209V/T237S/C379C/V406V在55℃條件下孵育3 h后,轉(zhuǎn)化（45℃）400 g/L Glu,反應(yīng)4 h時(shí)GABA的含量達(dá)到2... 

【文章來(lái)源】：福建師范大學(xué)福建省

【文章頁(yè)數(shù)】：89 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

圖１－１全細(xì)胞催化過(guò)程ｐＨ變化??Ｆｉｇ．?１－１?Ｃｈａｎｇｅ?ｏｆ?ｐＨ?ｉｎ?ｗｈｏｌｅ?－Ｃｅｌｌ?Ｃａｔａｌｙｔｉｃ?ｐｒｏｃｅｓｓ??

福建師范大學(xué)魏杰碩士學(xué)位論文??圖１－１表示全細(xì)胞催化過(guò)程中的ｐＨ變化，轉(zhuǎn)化初始ｐＨ在３．４左右，前半小時(shí)??ｐＨ上升很快是因?yàn)轶w系內(nèi)谷氨酸開始轉(zhuǎn)化為中性的ＧＡＢＡ，而體系內(nèi)的谷氨酸溶??解度很低，從而使ｐＨ上升很快，當(dāng)體系中的ｐＨ上升至４．２－５．０之間時(shí)，上升趨勢(shì)??減緩是因?yàn)榇藭r(shí)的ｐＨ處于ＧＡＤ的活性最適ｐＨ范圍，谷氨酸的轉(zhuǎn)化速率和ＧＡＢＡ??合成速率不斷加快，本實(shí)驗(yàn)室前期的實(shí)驗(yàn)研宄表明ＧＡＢＡ有促進(jìn)谷氨酸溶解的作??用，因此體系中谷氨酸的轉(zhuǎn)化速率和溶解速率相互中和，當(dāng)ｐＨ上升至５．０后上升趨??勢(shì)加快然后趨于平緩，是因?yàn)樘幱谵D(zhuǎn)化后期，體系中的谷氨酸完全溶解并且含量逐??漸減少，此時(shí)ＧＡＤ的活力逐漸喪失，導(dǎo)致谷氨酸基本轉(zhuǎn)化不動(dòng)，反應(yīng)速率下降，??ｐＨ上升緩慢

Ｆｉｇ．?１－６?Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ?ｏｆ?Ｉｎｄｉｃａｔｏｒ?ｒａｔｉｏ??Ａ：?Ｃｈａｎｇｅ?ｏｆ?ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ?ｏｆ?ｉｎｄｉｃａｔｏｒ?Ｂ：?Ｃｈａｎｇｅ?ｏｆ?Ｃｏｌｏｒ?ｏｆ?ｉｎｄｉｃａｔｏｒ??由圖１－６Ｂ可知，不同比例的指示劑的顏色在不同ｐＨ下的變化有明顯區(qū)別。當(dāng)??ｐＨ升高至５．２以后，溴甲酚綠鈉指示劑的比例增加使顏色偏向于藍(lán)色，并且變化很??小，當(dāng)氯酚紅指示劑的比例增加吋，顏色偏向于紅色；當(dāng)ｐＨ＜３．７時(shí)，各比例指示??劑顏色都為黃色，說(shuō)明該指示劑在ｐＨ?３．７以上才有顏色變化；ｐＨ在４．７－５．２之間時(shí)，??處于轉(zhuǎn)化過(guò)程ｐＨ轉(zhuǎn)折點(diǎn)（ｐＨ?５．０），指示劑比例為１：１時(shí)顏色由藍(lán)綠色到深藍(lán)色再??到紫色，而其他比例的指示劑在這一區(qū)間顏色變化不明顯。圖Ａ為不同比例指示劑??在５７５?ｎｍ下的吸光度（全波長(zhǎng)掃描各比例指不劑的最大吸收波長(zhǎng)均為５７５?ｎｍ），??指示劑比例為１：１時(shí)的吸光度值變化最大，其它比例的指示劑吸光度值變化較小，??因此選擇氯酚紅－溴甲酚綠鈉指示劑的比例為１：１

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]普魯蘭酶突變體文庫(kù)高通量篩選方法的建立及應(yīng)用[J]. 聶簡(jiǎn)琪,陳阿娜,劉秀霞,楊艷坤,白仲虎.  食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào). 2016(09)
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[3]采用易錯(cuò)PCR對(duì)粘質(zhì)沙雷氏菌幾丁質(zhì)酶C進(jìn)行定向進(jìn)化[J]. 劉治江,賀淹才,李紅然,劉嘉,施騰鑫.  華僑大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版). 2010(01)
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[5]γ-氨基丁酸的發(fā)現(xiàn)史[J]. 葉惟泠.  生理科學(xué)進(jìn)展. 1986(02)

碩士論文
[1]轉(zhuǎn)化法合成γ-氨基丁酸的霉菌篩選及條件優(yōu)化[D]. 田東亮.齊魯工業(yè)大學(xué) 2013
[2]微生物細(xì)胞催化合成γ-氨基丁酸（GABA）的研究[D]. 韓雪.哈爾濱商業(yè)大學(xué) 2013



本文編號(hào)：3233406