腈水合酶（EC 4.2.1.84）是微生物體內(nèi)代謝臆類物質(zhì)的關(guān)鍵酶之一,可以催化腈水合成相應(yīng)的酰胺。由于其催化效率高、反應(yīng)條件溫和、環(huán)境友好等特點(diǎn),腈水合酶已經(jīng)成功的應(yīng)用于化學(xué)工業(yè)中合成酰胺類物質(zhì)。腈水合酶基因一般以基因簇形式存在,包含α亞基,β亞基和激活蛋白。本實(shí)驗(yàn)室前期將來源于Aurantingaas manganoxydans SI85-9A1的腈水合酶基因NH08克隆并構(gòu)建在重組大腸桿菌中。然而,β亞基的表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于α亞基,激活蛋白表達(dá)量也偏低。本文首先通過融合標(biāo)簽策略、雙質(zhì)粒策略、多順反子策略等一系列研究,使激活蛋白的表達(dá)量提高了 5.14倍,酶活提高了 44.6%,達(dá)到120U/mL。其次,通過同義突變策略,使β亞基的表達(dá)量提高了 33%,最終酶活達(dá)到160U/mL。比酶活達(dá)到了 620.2U/mg,提高了 52.9%。再次,通過搖瓶培養(yǎng)條件優(yōu)化,酶活達(dá)到了 1531.2U/mL,OD600達(dá)到了 15.6。最后在15L罐中進(jìn)行高密度發(fā)酵,酶活達(dá)到了 9080U/mL,OD600達(dá)到123。目前谷氨酸棒桿菌被廣泛的應(yīng)用于代謝工程研究中,利用其為宿主進(jìn)行蛋白表達(dá)的研究相對較... 

【文章來源】：浙江大學(xué)浙江省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

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致謝
摘要
Abstract
縮寫符號術(shù)語表
第一章 緒論
    1.1 腈水合酶概述
        1.1.1 腈水合酶的來源
        1.1.2 腈水合酶的種類
        1.1.3 腈水合酶的結(jié)構(gòu)特征
        1.1.4 腈水合酶的催化機(jī)理
        1.1.5 腈水合酶的性質(zhì)
    1.2 常見酶的表達(dá)體系和表達(dá)優(yōu)化
        1.2.1 酶的表達(dá)體系
            1.2.1.1 大腸桿菌
            1.2.1.2 枯草芽孢桿菌
            1.2.1.3 谷氨酸棒桿菌
            1.2.1.4 酵母
        1.2.2 表達(dá)優(yōu)化
            1.2.2.1 復(fù)制子
            1.2.2.2 啟動子
            1.2.2.3 密碼子
            1.2.2.4 翻譯起始區(qū)域
            1.2.2.5 融合標(biāo)簽
            1.2.2.6 高密度發(fā)酵
    1.3 腈水合酶的重組表達(dá)現(xiàn)狀
        1.3.1 腈水合酶在大腸桿菌中的表達(dá)
        1.3.2 腈水合酶在其他宿主中的表達(dá)
    1.4 腈水合酶的工業(yè)應(yīng)用
        1.4.1 醫(yī)藥化工行業(yè)
        1.4.2 精細(xì)化工行業(yè)
        1.4.3 食品飼料添加劑行業(yè)
        1.4.4 環(huán)境修復(fù)
    1.5 論文的研究目標(biāo)
    1.6 論文的研究思路和內(nèi)容
第二章 大腸桿菌中腈水合酶的增強(qiáng)表達(dá)
    2.1 引言
    2.2 材料與方法
        2.2.1 實(shí)驗(yàn)儀器
        2.2.2 實(shí)驗(yàn)藥品與試劑
        2.2.3 培養(yǎng)基與試劑配制
        2.2.4 菌種和質(zhì)粒
        2.2.5 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞制作
        2.2.6 轉(zhuǎn)化與驗(yàn)證
        2.2.7 DNA操作
            2.2.7.1 質(zhì)粒提取
            2.2.7.2 普通PCR
            2.2.7.3 重疊延伸PCR
            2.2.7.4 全質(zhì)粒PCR定點(diǎn)突變
            2.2.7.5 DNA凝膠回收
            2.2.7.6 快速克隆
        2.2.8 表達(dá)載體構(gòu)建
            2.2.8.1 載體pCDFDuet-acc的構(gòu)建
            2.2.8.2 載體pCDFDuet-acc（SK）的構(gòu)建
            2.2.8.3 載體pCDFDuet-acc（SKI）的構(gòu)建
            2.2.8.4 載體pCDFDuet-acc（SKIK）的構(gòu)建
            2.2.8.5 載體pET28-α-β-acc（SKI）的構(gòu)建
            2.2.8.6 載體pET28-α-β-acc（SKIK）的構(gòu)建
            2.2.8.7 載體pCDFDuet-β的構(gòu)建
            2.2.8.8 載體pCDFDuet-β（SKI）的構(gòu)建
            2.2.8.9 載體pCDFDuet-β（SKIK）的構(gòu)建
            2.2.8.10 載體pET28-α-β（SKI）-acc（SKIK）的構(gòu)建
            2.2.8.11 載體pET28-α-β（SKIK）-acc（SKIK）的構(gòu)建
            2.2.8.12 載體pET28-α（mut）-β-acc（SKIK）的構(gòu)建
        2.2.9 mRNA結(jié)構(gòu)分析
        2.2.10 重組腈水合酶的誘導(dǎo)和表達(dá)
        2.2.11 菌體收集和細(xì)胞破碎
        2.2.12 SDS-PAGE電泳
        2.2.13 蛋白質(zhì)純化
        2.2.14 腈水合酶酶活測定
    2.3 結(jié)果與討論
        2.3.1 激活蛋白的增強(qiáng)表達(dá)
            2.3.1.1 激活蛋白單質(zhì)粒表達(dá)
            2.3.1.2 雙質(zhì)粒共表達(dá)策略
            2.3.1.3 多順反子策略
        2.3.2 β亞基的增強(qiáng)表達(dá)
            2.3.2.1 β亞基單獨(dú)增強(qiáng)表達(dá)
            2.3.2.2 多順反子策略
            2.3.2.3 同義突變策略
        2.3.3 重組腈水合酶的純化與比酶活測定
    2.4 本章小結(jié)
第三章 谷氨酸棒桿菌異源表達(dá)腈水合酶系統(tǒng)構(gòu)建
    3.1 引言
    3.2 材料與方法
        3.2.1 實(shí)驗(yàn)儀器
        3.2.2 實(shí)驗(yàn)藥品與試劑
        3.2.3 培養(yǎng)基配制
        3.2.4 質(zhì)粒與菌種
        3.2.5 感受態(tài)細(xì)胞制作
        3.2.6 轉(zhuǎn)化與驗(yàn)證
        3.2.7 DNA操作
        3.2.8 表達(dá)載體的構(gòu)建
            3.2.8.1 載體pXMJ 19-P43-NH08的構(gòu)建
            3.2.8.2 載體pXMJ 19-PilvC-NH08的構(gòu)建
            3.2.8.3 載體pEC-XK99E-NH08的構(gòu)建
            3.2.8.4 載體pEKEX2-NH08的構(gòu)建
            3.2.8.5 載體pEKEX2-NHopt的構(gòu)建
            3.2.8.6 載體pEKEX2-SD50000-NHopt的構(gòu)建
            3.2.8.7 載體pEKEX2-SD 100000-NHopt的構(gòu)建
            3.2.8.8 載體pEKEX2-mmp-SD50000-NHopt的構(gòu)建
            3.2.8.9 載體pEKEX2-de3-SD50000-NHopt的構(gòu)建
        3.2.9 密碼子優(yōu)化
        3.2.10 SD序列設(shè)計(jì)
        3.2.11 重組腈水合酶的誘導(dǎo)和表達(dá)
        3.2.12 菌體收集和細(xì)胞破碎
        3.2.13 SDS-PAGE
        3.2.14 腈水合酶酶活測定
    3.3 結(jié)果與討論
        3.3.1 腈水合酶的組成型表達(dá)
        3.3.2 腈水合酶的誘導(dǎo)型表達(dá)
        3.3.3 密碼子優(yōu)化
        3.3.4 SD序列的設(shè)計(jì)
        3.3.5 新型表達(dá)系統(tǒng)的引入
    3.4 本章小結(jié)
第四章 重組大腸桿菌發(fā)酵
    4.1 引言
    4.2 材料與方法
        4.2.1 實(shí)驗(yàn)儀器
        4.2.2 實(shí)驗(yàn)藥品與試劑
        4.2.3 菌株
        4.2.4 培養(yǎng)基
        4.2.5 培養(yǎng)方法
        4.2.6 搖瓶優(yōu)化
        4.2.7 分析方法
    4.3 結(jié)果與討論
        4.3.1 培養(yǎng)基優(yōu)化
            4.3.1.1 不同氮源比較
            4.3.1.2 復(fù)合氮源優(yōu)化
            4.3.1.3 復(fù)合氮源比例優(yōu)化
            4.3.1.4 復(fù)合氮源濃度優(yōu)化
            4.3.1.5 不同碳源比較
            4.3.1.6 碳源濃度比較
        4.3.2 誘導(dǎo)條件優(yōu)化
            4.3.2.1 不同誘導(dǎo)劑比較
            4.3.2.2 誘導(dǎo)劑濃度優(yōu)化
            4.3.2.3 鈷離子濃度優(yōu)化
            4.3.2.4 誘導(dǎo)溫度優(yōu)化
        4.3.3 重組大腸桿菌的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)
    4.4 本章小結(jié)
第五章 重組谷氨酸棒桿菌發(fā)酵
    5.1 引言
    5.2 材料與方法
        5.2.1 實(shí)驗(yàn)儀器
        5.2.2 實(shí)驗(yàn)藥品與試劑
        5.2.3 發(fā)酵菌種
        5.2.4 培養(yǎng)基
        5.2.5 培養(yǎng)方法
        5.2.6 搖瓶優(yōu)化
        5.2.7 分析方法
    5.3 結(jié)果與討論
        5.3.1 培養(yǎng)基優(yōu)化
            5.3.1.1 不同氮源比較
            5.3.1.2 氮源濃度優(yōu)化
            5.3.1.3 不同碳源比較
            5.3.1.4 生長因子優(yōu)化
        5.3.2 誘導(dǎo)條件優(yōu)化
            5.3.2.1 IPTG濃度
            5.3.2.2 鈷離子濃度
            5.3.2.3 誘導(dǎo)溫度
        5.3.3 重組谷氨酸棒桿菌的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)
    5.4 本章小結(jié)
第六章 重組腈水合酶催化制備酰胺初探
    6.1 引言
    6.2 材料與方法
        6.2.1 實(shí)驗(yàn)儀器
        6.2.2 實(shí)驗(yàn)藥品與試劑
        6.2.3 菌株
        6.2.4 培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法
        6.2.5 靜息細(xì)胞的制備
        6.2.6 全細(xì)胞催化制備酰胺
            6.2.6.1 重組大腸桿菌分批補(bǔ)料催化制備煙酰胺
            6.2.6.2 重組谷氨酸棒桿菌全細(xì)胞催化制備煙酰胺
            6.2.6.3 重組大腸桿菌催化制備2,6-二氟苯甲酰胺
    6.3 結(jié)果與討論
        6.3.1 重組大腸桿菌制備煙酰胺
        6.3.2 重組谷氨酸棒桿菌制備煙酰胺
            6.3.2.1 溫度和溫度穩(wěn)定性
            6.3.2.2 最適pH
            6.3.2.3 不同底物濃度對反應(yīng)的影響
            6.3.2.4 分批補(bǔ)料制備煙酰胺
        6.3.3 重組大腸桿菌制備2,6-二氟苯甲酰胺工藝研究
            6.3.3.1 最適溫度和溫度穩(wěn)定性
            6.3.3.2 最適pH和無緩沖液催化體系
            6.3.3.3 助溶劑的篩選
            6.3.3.4 不同底物投料方式比較
            6.3.3.5 底物添加量對反應(yīng)影響
            6.3.3.6 50 L反應(yīng)體系
    6.4 本章小結(jié)
第七章 結(jié)論與展望
    7.1 結(jié)論
    7.2 本論文的創(chuàng)新點(diǎn)
    7.3 展望
參考文獻(xiàn)
附錄
在學(xué)期間所取得的科研成果


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]酵母表達(dá)系統(tǒng)研究概述[J]. 田曉娟.  隴東學(xué)院學(xué)報(bào). 2018(01)
[2]ISOLATION,CHARACTERIZATION AND EXPRESSION OF THE COMPLEMENTARY DNA FOR HUMAN TUMOR NECROSIS FACTOR （TNF-α）[J]. 肖蕾,田園,王秀琴,賈鳳蘭,吳旻.  Science in China,Ser.B. 1990(10)



本文編號：3162830