半纖維素資源是自然界中最豐富的可再生資源之一,將其通過微生物轉(zhuǎn)化方法生產(chǎn)木糖醇是高值化利用的有效途徑。本論文在實(shí)驗(yàn)室已有工作的基礎(chǔ)上,利用CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù),對(duì)E.coli W3110進(jìn)行代謝工程改造,強(qiáng)化其輔酶NADPH的再生,構(gòu)建一株多拷貝整合木糖還原酶高產(chǎn)木糖醇的菌株。本工作采用雙質(zhì)粒CRISPR系統(tǒng),通過構(gòu)建不同pTargetF質(zhì)粒和修復(fù)模板,使用木糖還原酶基因表達(dá)模塊替換ptsG、ptsF和xylAB基因,獲得一株整合了 3個(gè)木糖還原酶基因拷貝數(shù)的出發(fā)菌株WZ04。并在此基礎(chǔ)上,分析大腸桿菌的葡萄糖代謝通路,通過實(shí)驗(yàn)分別敲除EMP途徑中編碼磷酸果糖激酶的pfkA、pfkB基因及磷酸葡萄糖異構(gòu)酶的pgi基因和轉(zhuǎn)氫酶sthA基因,獲得相應(yīng)的工程菌并檢測胞內(nèi)NADPH/NADP+的比值和發(fā)酵液中的木糖醇含量,獲得了最優(yōu)改造后的菌株WZ41。該菌株胞內(nèi)輔酶NADPH/NADP+比值為出發(fā)菌株的1.68倍,有效地提高了木糖醇對(duì)葡萄糖的得率;通過RT-qPCR、菌株的生長性能及搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)木糖醇的能力綜合分析得出木糖還原酶表達(dá)模塊的整合拷貝數(shù)最佳為5,使用該菌株進(jìn)行搖瓶... 

【文章來源】：浙江大學(xué)浙江省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：93 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
致謝
摘要
Abstract
中英文縮寫對(duì)照表
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1.1 木糖及木糖醇概述
    1.2 木糖醇的功能及市場
    1.3 木糖醇的產(chǎn)能及生產(chǎn)方式
        1.3.1 木糖醇的化學(xué)合成
        1.3.2 木糖醇的生物轉(zhuǎn)化
    1.4 生產(chǎn)木糖醇微生物的分子生物學(xué)改造策略
        1.4.1 CCR效應(yīng)的消除
        1.4.2 木糖代謝途徑的改造
        1.4.3 木糖還原酶的改造
        1.4.4 木糖醇的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)改造
        1.4.5 副產(chǎn)物阿拉伯糖醇的消除
    1.5 重組大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)木糖醇的研究進(jìn)展
        1.5.1 木糖還原酶基因在大腸桿菌中的異源表達(dá)
        1.5.2 內(nèi)源性輔酶NAD（P）H對(duì)木糖醇生產(chǎn)效率的影響
    1.6 基因組編輯技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用
        1.6.1 傳統(tǒng)基因組編輯技術(shù)的發(fā)展現(xiàn)狀
        1.6.2 CRISPR/Cas9編輯技術(shù)的發(fā)展
    1.7 本課題的研究內(nèi)容和意義
第二章 基于CRISPR/Cas9技術(shù)的整合型表達(dá)菌株的構(gòu)建
    2.1 引言
    2.2 實(shí)驗(yàn)材料
        2.2.1 菌株和質(zhì)粒
        2.2.2 儀器和設(shè)備
        2.2.3 常用試劑、試劑盒和培養(yǎng)基配方
    2.3 實(shí)驗(yàn)方法
        2.3.1 CRISPR-Cas9質(zhì)粒的構(gòu)建
        2.3.2 基因組基因替換方法操作
        2.3.3 基因替換驗(yàn)證
        2.3.4 SDS-PAGE蛋白膠
        2.3.5 種子液制備
        2.3.6 搖瓶發(fā)酵
        2.3.7 糖和糖醇的液相檢測方法
    2.4 結(jié)果與討論
        2.4.1 CRISPR-Cas9構(gòu)建整合型表達(dá)菌株
        2.4.2 重組菌搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)木糖醇
    2.5 小結(jié)
第三章 葡萄糖代謝途徑改造強(qiáng)化胞內(nèi)輔酶NADPH再生
    3.1 引言
    3.2 實(shí)驗(yàn)材料
        3.2.1 菌株和質(zhì)粒
        3.2.2 儀器和試劑
    3.3 實(shí)驗(yàn)方法
        3.3.1 大腸桿菌葡萄糖代謝通路分析
        3.3.2 不同位點(diǎn)整合對(duì)木糖還原酶的表達(dá)影響
        3.3.3 內(nèi)源性輔酶的定量測定[87]
        3.3.4 大腸桿菌溶源化改造
        3.3.5 搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)
    3.4 結(jié)果與討論
        3.4.1 EMP途徑基因敲除對(duì)胞內(nèi)輔酶含量的影響
        3.4.2 不同位點(diǎn)整合木糖還原酶基因?qū)ζ滢D(zhuǎn)錄水平的影響
        3.4.3 單個(gè)基因替換對(duì)內(nèi)源性輔酶生成量和木糖醇產(chǎn)量的影響
        3.4.4 組合敲除不同基因?qū)?nèi)源性輔酶和木糖醇產(chǎn)量的影響
    3.5 小結(jié)
第四章 木糖還原酶整合模塊拷貝數(shù)的優(yōu)化
    4.1 引言
    4.2 實(shí)驗(yàn)材料
    4.3 實(shí)驗(yàn)方法
        4.3.1 基因多拷貝整合
        4.3.2 大腸桿菌RNA的提取
        4.3.3 RT-qPCR對(duì)探究最佳拷貝數(shù)數(shù)量
        4.3.4 搖瓶發(fā)酵對(duì)木糖醇生產(chǎn)能力的驗(yàn)證
    4.4 結(jié)果與討論
        4.4.1 mRNA水平與木糖還原酶拷貝數(shù)的關(guān)系
        4.4.2 不同拷貝數(shù)的菌株木糖醇的生產(chǎn)能力
    4.5 小結(jié)
第五章 利用半纖維素水解液發(fā)酵生產(chǎn)木糖醇
    5.1 引言
    5.2 實(shí)驗(yàn)材料
    5.3 實(shí)驗(yàn)方法
        5.3.1 發(fā)酵原料的處理
        5.3.2 一級(jí)種子液培養(yǎng)
        5.3.3 二級(jí)種子液培養(yǎng)
        5.3.4 發(fā)酵過程控制
    5.4 結(jié)果與討論
        5.4.1 搖瓶發(fā)酵結(jié)果
        5.4.2 利用半纖維素水解液和木糖母液發(fā)酵生產(chǎn)木糖醇
    5.5 小結(jié)
第六章 結(jié)論與展望
    6.1 結(jié)論
    6.2 展望
        6.2.1 進(jìn)一步增加木糖醇對(duì)葡萄糖的得率
        6.2.2 阿拉伯糖代謝通路增強(qiáng)
        6.2.3 木糖殘?zhí)堑南?br>        6.2.4 生物質(zhì)資源的綜合利用
參考文獻(xiàn)
個(gè)人簡介


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]crp基因突變對(duì)大腸桿菌利用混合碳源的影響[J]. 熊得王,劉晴,姚瑞蓮,劉沅楓,張雪洪.  高�；瘜W(xué)工程學(xué)報(bào). 2015(06)
[2]CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)及其在動(dòng)物基因組定點(diǎn)修飾中的應(yīng)用[J]. 周金偉,徐綺嬪,姚婧,余樹民,曹隨忠.  遺傳. 2015(10)



本文編號(hào)：3162234