β-丙氨酸是天然存在的唯一β-型氨基酸,是輔酶A和泛酸等功能性化合物合成的前體。和傳統(tǒng)化學(xué)合成法相比,以L-天冬氨酸為底物的酶轉(zhuǎn)化法反應(yīng)溫和、轉(zhuǎn)化率高,是目前最受關(guān)注的β-丙氨酸生物制備方法之一。但是其關(guān)鍵酶L-天冬氨酸α-脫羧酶（PanD）存在嚴(yán)重的機(jī)制性失活,且底物價(jià)格昂貴,限制了規(guī)�；a(chǎn)。本研究發(fā)展了以廉價(jià)的富馬酸為起始底物,通過偶聯(lián)PanD和L-天冬氨酸酶（AspA）催化富馬酸生成β-丙氨酸的工藝路線。通過蛋白質(zhì)工程改造,提高PanD的催化穩(wěn)定性,進(jìn)一步結(jié)合蛋白表達(dá)調(diào)控策略,優(yōu)化共表達(dá)菌株雙酶表達(dá)水平,使AspA和PanD具有良好的協(xié)同性,顯著提高了級(jí)聯(lián)路徑的轉(zhuǎn)化效率。主要研究結(jié)果如下:（1）設(shè)計(jì)、構(gòu)建與驗(yàn)證了級(jí)聯(lián)生產(chǎn)β-丙氨酸的路徑。首先,篩選到Bacillus subtilis來源的L-天冬氨酸α-脫羧酶（BsPanD）和Escherichia coli來源的L-天冬氨酸酶（EcAspA）作為級(jí)聯(lián)反應(yīng)的路徑酶;其次,體外反應(yīng)檢測(cè)到產(chǎn)物β-丙氨酸的生成,驗(yàn)證了該級(jí)聯(lián)路徑的可行性;最后,通過體內(nèi)轉(zhuǎn)化反應(yīng),鑒定了PanD存在嚴(yán)重的機(jī)制性失活現(xiàn)象,導(dǎo)致催化穩(wěn)定性差,是該級(jí)聯(lián)反應(yīng)的... 

【文章來源】：江南大學(xué)江蘇省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：58 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

β-丙氨酸化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1-1Chemicalstructuralformulaofβ-alanine.

?原核生物來源的PanD酶催化L-天冬氨酸脫羧生成β-丙氨酸的反應(yīng)過程高度相似，具體可被分成四步，以晶體結(jié)構(gòu)已經(jīng)被解析的M.tuberculosis為例進(jìn)行介紹[43]，如圖1-2所示：(1)PanD自剪切后在Ser25處形成的丙酮�；鶊F(tuán)和底物L(fēng)-天冬氨酸形成了一個(gè)席夫堿結(jié)構(gòu)；(2)第一步中生成的酶-底物席夫堿的中間體通過脫羧作用，釋放二氧化碳，從而形成一個(gè)烯醇結(jié)構(gòu)；(3)Tyr58酚基上的“H+”攻擊第二步中生成的烯醇結(jié)構(gòu)的中間體，形成β-丙氨酸的亞胺加合物；(4)酶與產(chǎn)物的復(fù)合物通過水解作用釋放產(chǎn)物β-丙氨酸，丙酮�；鶊F(tuán)(活性基團(tuán))再生。圖1-2L-天冬氨酸α-脫羧酶催化反應(yīng)機(jī)理Fig.1-2MechanismofPanDcatalysispathways.1.3.3L-天冬氨酸α-脫羧酶的蛋白質(zhì)改造進(jìn)展蛋白質(zhì)工程改造能夠解決天然酶酶活低、穩(wěn)定性差、產(chǎn)物抑制等問題，因此，它被廣泛應(yīng)用于酶法生產(chǎn)化學(xué)品的研究中[44-46]。近幾年，L-天冬氨酸α-脫羧酶在蛋白質(zhì)工程改造方面也得到了一定的發(fā)展。因?yàn)楸疚难芯康氖窃松飦碓吹腜anD，所以，這里僅介紹了這類來源的PanD蛋白質(zhì)工程改造進(jìn)展。原核生物來源的PanD的改造多集中

3.1級(jí)聯(lián)反應(yīng)生產(chǎn)β-丙氨酸的設(shè)計(jì)、構(gòu)建和驗(yàn)證3.1.1級(jí)聯(lián)路徑的設(shè)計(jì)級(jí)聯(lián)催化富馬酸生產(chǎn)β-丙氨酸的反應(yīng)分為兩步：(1)富馬酸經(jīng)過L-天冬氨酸酶(AspA)的加氨作用生成L-天冬氨酸；(2)L-天冬氨酸經(jīng)過L-天冬氨酸α-脫羧酶(PanD)的脫羧作用生成β-丙氨酸。通過偶聯(lián)AspA和PanD，可以實(shí)現(xiàn)一鍋法轉(zhuǎn)化富馬酸制備β-丙氨酸�；贐RENDA數(shù)據(jù)庫中的比酶活數(shù)據(jù)，分別篩選出6種不同來源的PanD和6種不同來源的AspA，再通過分子生物學(xué)手段在E.coli中異源表達(dá)這些潛在催化效率較高的蛋白，比較并最終選定最適的酶源，從而實(shí)現(xiàn)級(jí)聯(lián)路徑的構(gòu)建。圖3-1級(jí)聯(lián)反應(yīng)催化富馬酸生成β-丙氨酸的路徑設(shè)計(jì)Fig.3-1Designandreconstructionofβ-alaninebiosynthesispathwayfromfumaricacidbythedual-enzymesystemcontainingAspAandPanD.3.1.2L-天冬氨酸α-脫羧酶重組菌的構(gòu)建以枯草芽孢桿菌B.subtilis來源的PanD菌株構(gòu)建為例，構(gòu)建過程如下：(1)將B.subtilis活化培養(yǎng)，按照步驟2.2.1所述方法提取其基因組，利用擴(kuò)增引物BsPanD-S和BsPanD-A，以提取的B.subtilis基因組為模板，克隆panD基因，再利用BamHI和HindIII酶切位點(diǎn)將其插入到pET28a(+)質(zhì)粒(具體構(gòu)建流程見步驟2.2.3)，構(gòu)建完成的菌株命名為pET28a-BsPanD。(2)使用TB培養(yǎng)基對(duì)重組菌株pET28a-BsPanD進(jìn)行培養(yǎng)和誘導(dǎo)表達(dá)，然后收集菌體、重懸并進(jìn)行超聲破碎，再利用His親和柱進(jìn)行純化，純化效果由SDS-PAGE驗(yàn)證。如圖3-2(B)所示，在12kDa左右有較粗的蛋白條帶，與BsPanD的理論分子量一致，證明了BsPanD在E.coli中實(shí)現(xiàn)了可溶性表達(dá)，且純化出的條帶單一，純化效果較好。(3)對(duì)純化出的BsPanD蛋白進(jìn)行體外酶活測(cè)定，如表3-1所示，BsPanD的比酶活為3.25U·mg-1protein。按照上述步驟(1)獲得來源于C.glutamicum的PanD編碼基因，此外，通

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]β-氨基丙酸的合成與應(yīng)用[J]. 羅積杏,薛建萍,沈寅初.  氨基酸和生物資源. 2005(01)

博士論文
[1]薯蕷皂素的酶促糖基化以及相關(guān)化合物的生物合成研究[D]. 董青.華東理工大學(xué) 2011

碩士論文
[1]L-天冬氨酸-α-脫羧酶的蛋白質(zhì)工程改造及其在β-丙氨酸生產(chǎn)中的應(yīng)用[D]. 陳虹.浙江工業(yè)大學(xué) 2019
[2]構(gòu)象動(dòng)力學(xué)方法改造酶性能以生產(chǎn)醫(yī)藥中間體[D]. 楊彬.江南大學(xué) 2018
[3]L-天冬氨酸α-脫羧酶的表達(dá)、改造及全細(xì)胞制備β-丙氨酸[D]. 張騰輝.江南大學(xué) 2018
[4]一釜雙酶法轉(zhuǎn)化富馬酸制備β-丙氨酸催化體系的構(gòu)建及工藝優(yōu)化[D]. 高宇.江南大學(xué) 2017
[5]代謝工程改造大腸桿菌合成β-丙氨酸[D]. 梁姍姍.江南大學(xué) 2017
[6]β-丙氨酸對(duì)肉仔雞生產(chǎn)性能、肌肉品質(zhì)和肌源活性肽的影響[D]. 齊博.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 2017
[7]L-天冬氨酸α-脫羧酶生產(chǎn)β-丙氨酸的研究[D]. 高麗娟.浙江工業(yè)大學(xué) 2007



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