發(fā)布時(shí)間：2021-03-30 03:00

　　角質(zhì)酶是一種多功能水解酶,能夠水解短鏈或長鏈脂肪酸酯和甘油三酯,也可用于降解植物的多聚體角質(zhì),是棉織物生物精煉工業(yè)中的重要酶類。本研究首先將特異腐質(zhì)霉來源（Humicola insolens,H.insolens）的角質(zhì)酶基因（hic）在大腸桿菌（Escherichia coli,E.coli）中進(jìn)行重組表達(dá),研究其酶學(xué)性質(zhì);再通過3-L罐水平上的發(fā)酵優(yōu)化,進(jìn)一步提高該重組酶的表達(dá)水平;最后,對重組酶在棉織物生物精煉中的應(yīng)用進(jìn)行條件優(yōu)化。主要研究結(jié)果如下:1.實(shí)現(xiàn)了H.insolens來源的角質(zhì)酶基因在大腸桿菌中的克隆表達(dá)。構(gòu)建重組菌E.coli BL21（DE3）/pET-20b（+）//hic,將重組菌在搖瓶中培養(yǎng)24h,發(fā)酵上清液中的角質(zhì)酶活性為170 U·mL-1。通過硫酸銨沉淀、陽離子交換柱對重組角質(zhì)酶進(jìn)行純化,考察其酶學(xué)性質(zhì)。結(jié)果表明,重組酶的最適反應(yīng)溫度為80℃、最適pH為8.5;在80℃、pH 8.5條件下,重組酶半衰期為11 min;在60℃、pH 8.5條件下,重組酶的半衰期為14 h;在4℃、pH 5.0-10.0的條件下,均可保持長時(shí)間的穩(wěn)定;比活力1047 U... 

【文章來源】：江南大學(xué)江蘇省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：54 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

植物角質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)

圖 1-2 植物角質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig. 1-2 Chemical structure of Plant Cuticle1.2.3 蠟質(zhì)與角質(zhì)層水分滲透結(jié)構(gòu)模型蠟質(zhì)是角質(zhì)層的化學(xué)組成成分之一，成熟棉纖維中的蠟質(zhì)組成成分及其熔點(diǎn)如表1-2 所示。蠟質(zhì)在角質(zhì)層中以兩種不同的沉積方式存在：沉積于角質(zhì)層外表面或嵌入角質(zhì)層[53]。雖然蠟質(zhì)在角質(zhì)膜中所占的比例小于角質(zhì)，但卻是對角質(zhì)層滲透性起決定性作。Schreiber等[54]出并驗(yàn)證了三種角質(zhì)層水分滲透結(jié)構(gòu)模型的存在，模型如圖 1-3所示。沉積在角質(zhì)層外表面的蠟質(zhì)會形成疏水的限制性屏障，將水分子同纖維隔離開來。僅有少量水分子會通過表面上留有的極性聚合物通道進(jìn)入纖維內(nèi)層。有研究報(bào)道稱，將植物角質(zhì)層脫去蠟質(zhì)后, 角質(zhì)層的水分滲透性可 高142-2031倍[55]。由于蠟質(zhì)在纖維結(jié)構(gòu)中的位置和其疏水特性，去除蠟質(zhì)對 高棉織物的潤濕性有重要意義。在生物精煉中主要通過沸水預(yù)處理的方式，融化去除纖維表面蠟質(zhì)，暴露內(nèi)層角質(zhì)，加速酶反應(yīng)。

3.1 Humicola insolens 角質(zhì)酶在 E. coli 中的重組表達(dá)和酶學(xué)性質(zhì)研究3.1.1 重組質(zhì)粒 pET-20b(+)/hic 的構(gòu)建參照2.2.2的方法，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-20b(+)/hic，構(gòu)建流程如圖3-1所示。對構(gòu)建成功的質(zhì)粒，使用內(nèi)切酶Nco I和Hind III雙酶切驗(yàn)證，酶切驗(yàn)證電泳圖如圖3-2所示。在600 bp左右處出現(xiàn)了H. insolens角質(zhì)酶基因的特征條帶，4000 bp左右處出現(xiàn)了pET-20b(+)載體的特征條帶，重組質(zhì)粒pET-20b(+)/hic構(gòu)建成功。圖3-1 重組質(zhì)粒 pET-20b(+) / hic 的構(gòu)建流程Fig. 3-1 The construction process of recombinant plasimd pET-20b(+)/hic


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