尿苷作為抗病毒抗腫瘤藥物的中間體,具有極其重要的醫(yī)藥價(jià)值,已廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥行業(yè)。微生物發(fā)酵法生產(chǎn)尿苷具有條件溫和,操作簡單,易操作等優(yōu)點(diǎn),是工業(yè)化生產(chǎn)尿苷的理想方法,高產(chǎn)尿苷的優(yōu)良菌種構(gòu)建是發(fā)酵法生產(chǎn)的前提條件。本研究采用CRISPR/Cas 9介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)對(duì)野生型大腸桿菌Escherichia coli W3110進(jìn)行系統(tǒng)的代謝工程改造,構(gòu)建尿苷高產(chǎn)菌株。首先,將Bacillus subtilis A260的嘧啶核苷操縱子基因整合至E.coli W3110基因組上,構(gòu)建了菌株UR1。搖瓶發(fā)酵結(jié)果顯示,菌株UR1的發(fā)酵液中尿苷的濃度呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢,然而副產(chǎn)物尿嘧啶在整個(gè)發(fā)酵周期不斷積累;發(fā)酵32 h,尿苷產(chǎn)量為3g/L,尿嘧啶產(chǎn)量為4.5g/L。其次,為了減少副產(chǎn)物尿嘧啶的積累,阻斷了尿苷的降解,敲除與尿苷分解代謝相關(guān)的基因（udp,udk,rihA/B/C）,構(gòu)建菌UR2-5。搖瓶發(fā)酵結(jié)果顯示,尿苷產(chǎn)量為7.8 g/L,與菌株UR1相比提高了 136%,但副產(chǎn)物尿嘧啶仍有少量積累,產(chǎn)量為0.6 g/L。最后,為了進(jìn)一步增加尿苷的積累量,對(duì)尿苷合成的前體物質(zhì)氨甲酰磷酸,天... 

【文章來源】：天津科技大學(xué)天津市

【文章頁數(shù)】：75 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

咯暄操縱子的結(jié)構(gòu)

????合成尿苷最重要的前體物質(zhì)有三種：氨甲酰磷酸、天冬氨酸和ＰＲＰＰ。??氨甲酰磷酸的合成主要是由氨甲酰憐酸合成酶催化完成的，氨甲酰磷酸合成酶是??尿苷合成途徑的第一步反應(yīng)，是尿苷合成的限速步驟，大腸桿菌自身的氨甲酰磷酸合??成酶受到多種因素的嚴(yán)格調(diào)控。之前實(shí)驗(yàn)通過整合解除反饋調(diào)節(jié)的氨甲酰磷酸合成酶??的突變體的操縱子，使野生型的大腸桿菌具備了積累尿苷的能力。探究過表達(dá)氨甲酰??磷酸合成酶對(duì)尿苷合成的影響。??天冬氨酸參與尿苷合成的第二步反應(yīng)，在天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶作用下同氨甲酰磷??酸合成氨甲酰天冬氨酸。天冬氨酸還是多種氨基酸如蘇氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸和賴??氨酸的前體物。探宄切斷天冬氨酸到高絲氨酸的代謝途徑對(duì)尿苷合成的影響，即敲除??／／７ｒ／ｌ?基因。??ＰＲＰＰ是尿苷從頭合成的關(guān)鍵前體物，胞內(nèi)ＰＲＰＰ的濃度直接影響尿苷的生成，??并且由于ＰＲＰＰ同時(shí)受嘧啶核苷、嘌呤核苷、色氨酸的調(diào)控，其胞內(nèi)濃度一般較低，??因此ＰＲＰＰ的量是尿苷合成的一個(gè)重要的限制因素。ＰＲＰＰ合成酶（由基因編碼）??是ＰＲＰＰ合成的關(guān)鍵酶，探宄過表達(dá)ＰＲＰＰ合成酶對(duì)尿苷合成的影響。??１．６．３本論文的技術(shù)路線??本論文的技術(shù)路線見圖１－７??

?ｊ?圖３．１生物體內(nèi)嘧啶核苷的從頭合成途徑??Ｆｉｇ．?３－１?Ｄｅ?ｎｏｖｏ?ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ?ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ?ｐａｔｈｗａｙ??：Ｕ）??

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]關(guān)鍵基因的修飾對(duì)枯草芽孢桿菌尿苷合成的影響[J]. 楊紹梅,郭磊,班睿,謝希賢.  微生物學(xué)報(bào). 2016(01)
[2]過表達(dá)carAB和pyrBI對(duì)大腸桿菌發(fā)酵胞苷的影響[J]. 吳曉嬌,孫家凱,霍文婷,謝希賢,徐慶陽,陳寧.  中國生物工程雜志. 2012(02)
[3]微生物發(fā)酵法生產(chǎn)胞嘧啶核苷的研究進(jìn)展[J]. 方海田,謝希賢,徐慶陽,陳寧.  發(fā)酵科技通訊. 2010(03)
[4]枯草芽孢桿菌cdd基因敲除及對(duì)胞苷發(fā)酵的影響[J]. 蘇靜,黃靜,謝希賢,徐慶陽,陳寧.  生物技術(shù)通訊. 2010(01)
[5]利用抗CTP合成酶反饋抑制篩選胞苷高產(chǎn)突變株[J]. 李登奎,徐曉莉,黃雷鳴,陳穎,竇潔,周長林.  中國藥科大學(xué)學(xué)報(bào). 2009(05)
[6]尿苷菌種選育及發(fā)酵條件優(yōu)化[J]. 程遠(yuǎn)超,劉康樂,黃艷輝,徐慶陽,陳寧.  發(fā)酵科技通訊. 2009(04)
[7]核苷合成技術(shù)的研究進(jìn)展[J]. 徐淵,王鴻,易喻,梅建鳳,陳建澍,應(yīng)國清.  化工生產(chǎn)與技術(shù). 2009(02)
[8]胞苷生產(chǎn)菌的選育及發(fā)酵[J]. 張春艷,丁慶豹,許彥梅,魏曉琨,歐伶,張鷺.  中國熱帶醫(yī)學(xué). 2009(02)
[9]胞苷生產(chǎn)菌的選育[J]. 盛春雷,丁慶豹,丁翠敏,歐伶,邱蔚然.  生物技術(shù). 2007(05)
[10]嘧啶核苷的研究進(jìn)展[J]. 王銳.  生物技術(shù)通訊. 2007(03)

碩士論文
[1]常壓室溫等離子誘變結(jié)合高通量篩選選育尿苷產(chǎn)生菌[D]. 吳鶴云.天津科技大學(xué) 2016



本文編號(hào)：3069600