酵母的多倍體化和非整倍體化都屬于大范圍的基因組結(jié)構(gòu)變異,都是工業(yè)用酵母菌株的重要的遺傳變異形式,其中酵母交配型轉(zhuǎn)換是非常關(guān)鍵的一步。本研究開發(fā)了基于CRISPR/Cas9的酵母交配型轉(zhuǎn)換方法,通過一次酵母轉(zhuǎn)化,即可完成單倍體和二倍體酵母細(xì)胞的交配型轉(zhuǎn)換,且交配型轉(zhuǎn)換的效率均可達(dá)到80%以上。應(yīng)用CRISPR/Cas9介導(dǎo)的交配型轉(zhuǎn)換方法,本研究構(gòu)建了含有兩條合成型染色體（synV和synX）的單倍體酵母,并且實(shí)現(xiàn)了同源野生型三倍體、四倍體、五倍體酵母菌株的構(gòu)建。為了驗(yàn)證多倍體基因組重排的效果,我們將玉米黃質(zhì)生物合成模塊整合在野生型V號染色體上,構(gòu)建得到了產(chǎn)玉米黃質(zhì)的野生型二倍體、三倍體和四倍體酵母菌株,以及含有合成型染色體的雜合二倍體、三倍體和四倍體酵母菌株。本研究利用玉米黃質(zhì)的產(chǎn)量作為篩選酵母有益結(jié)構(gòu)變異的指標(biāo),在合成型多倍體酵母中誘導(dǎo)synV染色體的重排。研究發(fā)現(xiàn),synV三倍體重排酵母中玉米黃質(zhì)產(chǎn)量提升的菌株比例高達(dá)15%,玉米黃質(zhì)產(chǎn)量提升幅度最高達(dá)到3.80倍。對玉米黃質(zhì)產(chǎn)量提升的synV重排酵母進(jìn)行基因型分析,發(fā)現(xiàn)一次染色體重排即可獲得基因型多樣化的酵母文庫,包括非整倍體酵母... 

【文章來源】：天津大學(xué)天津市 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：88 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

本課題研究內(nèi)容Fig.1-1Thecontentofthisresearch

第 3 章 酵母交配型轉(zhuǎn)換3.1 引言由于 HO 基因的缺失或突變，實(shí)驗(yàn)室酵母菌株的交配型通常是比較穩(wěn)定的。以往轉(zhuǎn)換酵母交配型的方法是構(gòu)建含有 HO 基因的質(zhì)粒，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)入酵母中，利用 HO 核酸內(nèi)切酶促進(jìn)單倍體酵母菌株的交配型轉(zhuǎn)換[58]，如圖 3-1 所示。此外，可將 HO 基因置于半乳糖啟動子控制下，實(shí)現(xiàn)酵母交配型的誘導(dǎo)型互變，但這種方法的轉(zhuǎn)換效率并不高[14, 38, 59]。且利用此方法并不能轉(zhuǎn)換二倍體酵母的交配型。另外，如果刪除酵母菌株的 HMRa 和 HMRα 基因座，則通過上述方法并不能完成酵母交配型的轉(zhuǎn)換[60]，如 synIII 酵母染色體[2]在合成時(shí)將 HMRa 和HMRα 基因座刪除，故要想將 synIII 與其他的合成型酵母合并在一個(gè)酵母細(xì)胞中時(shí)，均需要轉(zhuǎn)換其交配型。

.2 酵母交配型轉(zhuǎn)換所需質(zhì)粒的構(gòu)建.2.1 gRNA 表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建利用 CRISPR gRNA 設(shè)計(jì)軟件對 20 bp 的前間隔序列（protospacers）進(jìn)行，將20 bp protospacers設(shè)計(jì)在Ya或Yα區(qū)域之前，使前間隔區(qū)相鄰基序（PAM MATa 或 MATα 處產(chǎn)生特定的雙鏈缺口 DSB，如圖 3-2 所示，從而使釀酒在有外源的 MATα 或 MATa 基因片段時(shí)發(fā)生同源重組，完成交配型的轉(zhuǎn)換 NotI 限制性內(nèi)切酶切割 gRNA 表達(dá)質(zhì)粒 pNA0304 并進(jìn)行凝膠回收。通過長 60 bp 含有 20 bp gRNA 片段的兩個(gè)單鏈寡核苷酸鏈退火產(chǎn)生 MAT 基因 gRNA 盒，其中 20 bp gRNA 盒的兩側(cè)各連接了 20 bp 與 pNA0304 表達(dá)載otI 酶切位點(diǎn)處同源的序列，據(jù)此利用 Gibson 組裝的方法將 20 bp gRNA 盒性的 pNA0304 表達(dá)載體進(jìn)行連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌，待轉(zhuǎn)化出來，提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切驗(yàn)證及測序分析。


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