鹵醇脫鹵酶能夠在溫和條件下催化鄰鹵醇脫鹵和環(huán)氧化物的開環(huán),在手性環(huán)氧化物和β-取代醇的合成方面具有極大的應(yīng)用潛力。但是到目前為止立體選擇性優(yōu)異的鹵醇脫鹵酶僅有HheC,為了滿足應(yīng)用的需求,開發(fā)新型高效、選擇性好、活性高的生物催化劑,已經(jīng)成為鹵醇脫鹵酶工業(yè)應(yīng)用基礎(chǔ)研究的重點(diǎn)研究方向。本文首先以HheC和HheB為基因探針,通過基因挖掘法獲得了10種潛在的鹵醇脫鹵酶基因,其中9種在大腸桿菌中成功表達(dá)。以苯基縮水甘油醚（（R,S）-PGE）為模式底物,通過顯色反應(yīng)和高效液相色譜檢測比較,篩選獲得3種高活性且具有不同選擇性的鹵醇脫鹵酶;經(jīng)引入組氨酸標(biāo)簽后,確定了一種來源于菌株P(guān)seudomonas pohangensis的HHDH_His10作為后續(xù)研究對(duì)象,其與HheB的同源性為44%,與HheC的同源性為31%,并對(duì)（R,S）-PGE表現(xiàn)出R選擇性。通過Ni-NTA柱純化目標(biāo)蛋白,并對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究。其最適脫鹵反應(yīng)溫度為40℃,最適脫鹵反應(yīng)pH為10.0,最適開環(huán)反應(yīng)pH為7.5,該酶在pH6.0-7.5范圍內(nèi)和溫度低于50℃時(shí)具有較好的穩(wěn)定性。HHDH_H... 

【文章來源】：江蘇科技大學(xué)江蘇省

【文章頁數(shù)】：95 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第1章 緒論
    1.1 鹵醇脫鹵酶
    1.2 鹵醇脫鹵酶的催化機(jī)理
    1.3 鹵醇脫鹵酶的基因挖掘
    1.4 鹵醇脫鹵酶的應(yīng)用
        1.4.1 鹵醇脫鹵酶在鹵代醇脫鹵反應(yīng)中的應(yīng)用
        1.4.2 鹵醇脫鹵酶在環(huán)氧化物拆分中的應(yīng)用
        1.4.3 鹵醇脫鹵酶在單酶串聯(lián)反應(yīng)中的應(yīng)用
        1.4.4 鹵醇脫鹵酶在與其他酶的偶聯(lián)反應(yīng)中的應(yīng)用
    1.5 鹵醇脫鹵酶的分子改造研究
        1.5.1 鹵醇脫鹵酶的定向進(jìn)化
        1.5.2 鹵醇脫鹵酶的理性或半理性設(shè)計(jì)
    1.6 本論文的研究目的及意義
    1.7 本論文的主要研究內(nèi)容
第2章 鹵醇脫鹵酶的基因挖掘
    2.1 引言
    2.2 實(shí)驗(yàn)材料
        2.2.1 主要設(shè)備與儀器
        2.2.2 菌株及質(zhì)粒
        2.2.3 酶與試劑
    2.3 實(shí)驗(yàn)方法
        2.3.1 培養(yǎng)基及常用試劑的配制
        2.3.2 鹵醇脫鹵酶的基因挖掘
        2.3.3 鹵醇脫鹵酶表達(dá)載體的構(gòu)建
        2.3.4 鹵醇脫鹵酶的誘導(dǎo)表達(dá)
        2.3.5 鹵醇脫鹵酶的序列分析
        2.3.6 鹵醇脫鹵酶的高通量篩選
        2.3.7 鹵醇脫鹵酶酶活測定
        2.3.8 分析方法
    2.4 結(jié)果與討論
        2.4.1 鹵醇脫鹵酶的基因挖掘
        2.4.2 鹵醇脫鹵酶的誘導(dǎo)表達(dá)
        2.4.3 重組鹵醇脫鹵酶的功能篩選
    2.5 本章小結(jié)
第3章 鹵醇脫鹵酶的酶學(xué)性質(zhì)研究
    3.1 引言
    3.2 實(shí)驗(yàn)材料
        3.2.1 實(shí)驗(yàn)儀器
        3.2.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑
        3.2.3 菌株與質(zhì)粒
        3.2.4 相關(guān)溶液的配制
    3.3 實(shí)驗(yàn)方法
        3.3.1 鹵醇脫鹵酶的純化
        3.3.2 鹵醇脫鹵酶最適溫度及溫度穩(wěn)定性
        3.3.3 鹵醇脫鹵酶最適pH及 pH穩(wěn)定性
        3.3.4 鹵醇脫鹵酶底物特異性
        3.3.5 鹵醇脫鹵酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)
        3.3.6 鹵醇脫鹵酶酶活測定
        3.3.7 分析方法
        3.3.8 鹵醇脫鹵酶催化拆分Rac-PGE合成手性純的PGE
        3.3.9 鹵醇脫鹵酶單酶串聯(lián)催化合成手性純的1-氯-3-苯氧基-2-丙醇
    3.4 結(jié)果與討論
        3.4.1 鹵醇脫鹵酶的分離純化
        3.4.2 溫度對(duì)鹵醇脫鹵酶HHDHHis10 的酶活及穩(wěn)定性的影響
        3.4.3 pH對(duì)鹵醇脫鹵酶的酶活及穩(wěn)定性的影響
        3.4.4 鹵醇脫鹵酶的底物特異性
        3.4.5 鹵醇脫鹵酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)的測定
        3.4.6 鹵醇脫鹵酶催化Rac-PGE合成手性純的PGE
        3.4.7 鹵醇脫鹵酶催化合成對(duì)映體純的1-氯-3-苯氧基-2-丙醇
    3.5 本章小結(jié)
第4章 鹵醇脫鹵酶分子改造的初步探索
    4.1 引言
    4.2 材料
        4.2.1 菌株與質(zhì)粒
        4.2.2 酶與試劑
        4.2.3 主要儀器
        4.2.4 引物
    4.3 實(shí)驗(yàn)方法
        4.3.1 同源建模
        4.3.2 分子對(duì)接
        4.3.3 感受態(tài)細(xì)胞的制備
        4.3.4 飽和突變文庫的構(gòu)建
        4.3.5 高通量篩選模型的建立與突變文庫的篩選
        4.3.6 鹵醇脫鹵酶HHDHHis10 及其突變體的表達(dá)與分離純化
        4.3.7 鹵醇脫鹵酶酶活測定
        4.3.8 鹵醇脫鹵酶及其突變體動(dòng)力學(xué)參數(shù)的測定
        4.3.9 分析方法
        4.3.10 突變體催化拆分Rac-PGE合成手性純的PGE
    4.4 結(jié)果與討論
        4.4.1 鹵醇脫鹵酶同源建模
        4.4.2 分子對(duì)接與突變位點(diǎn)的選擇
        4.4.3 突變文庫的構(gòu)建及篩選
        4.4.4 鹵醇脫鹵酶及其突變體的分離純化
        4.4.5 鹵醇脫鹵酶及其突變體的底物特異性
        4.4.6 動(dòng)力學(xué)常數(shù)的測定
        4.4.7 機(jī)理分析
        4.4.8 突變體N160L催化拆分（R,S）-PGE
    4.5 本章小結(jié)
第5章 結(jié)論與展望
    5.1 結(jié)論
    5.2 展望
參考文獻(xiàn)
附錄
攻讀碩士學(xué)位期間所發(fā)表的學(xué)術(shù)論文
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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博士論文
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碩士論文
[1]定向進(jìn)化提高鹵代醇脫鹵酶HHDH的催化活性[D]. 王金玉.浙江大學(xué) 2016
[2]基于定向進(jìn)化方法改進(jìn)鹵醇脫鹵酶HheC的熱穩(wěn)定性[D]. 武志赟.電子科技大學(xué) 2015
[3]鹵醇脫鹵酶C（HheC）的分子定向進(jìn)化研究[D]. 劉羽.電子科技大學(xué) 2013
[4]鹵醇脫鹵酶HheA的改造和生物催化特性的研究[D]. 朱學(xué)琛.電子科技大學(xué) 2012
[5]環(huán)氧水解酶的克隆表達(dá)和催化性能研究[D]. 趙晶.華東理工大學(xué) 2011
[6]鹵醇脫鹵酶HheC的改造及其在手性藥物合成中的應(yīng)用[D]. 鄭楷.電子科技大學(xué) 2011



本文編號(hào)：2924265