發(fā)布時間：2020-12-18 18:22

　　乙酰輔酶A合成酶（ACS）催化乙酰輔酶A的合成,它是油脂代謝和醋酸鹽代謝的重要節(jié)點之一。據(jù)報道,過表達ACS會導(dǎo)致醋酸鹽大量被轉(zhuǎn)化為acetyl-CoA,從而支持后續(xù)的糖酵解途徑、脂肪酸代謝、氨基酸代謝和糖異生作用,并加速細胞生長和物質(zhì)積累。本研究以特氏杜氏藻（Dunaliella tertiolecta）為主要研究對象,首先利用反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）技術(shù)得到了長度為1175 bp的DtACS EST序列,該片段經(jīng)Blast序列比對推斷為DtACS基因片段。然后通過cDNA末端快速擴增（RACE）技術(shù)獲得了長為790 bp的DtACS 5’端序列和長為784 bp的DtACS 3’端序列,經(jīng)序列拼接得到DtACS的全長cDNA序列為2464 bp,包含長為2184 bp的DtACS ORF序列,編碼727個氨基酸。經(jīng)氨基酸序列同源性分析,發(fā)現(xiàn)DtACS與綠藻ACS最為相似（與衣藻Chlamydomonas reinhardtii有68%一致;與團藻Volvox carteri f.nagariensis有70%一致）。生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示DtACS分子量為79.72 kDa,等... 

【文章來源】：華南理工大學(xué)廣東省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：83 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第一章 緒論
    1.1 微生物油脂及特氏杜氏藻
        1.1.1 微生物油脂
        1.1.2 微藻生物柴油
        1.1.3 杜氏藻屬及特氏杜氏藻
    1.2 乙酰CoA合成酶（ACS）及油脂代謝通路
        1.2.1 油脂代謝通路的基因工程研究
        1.2.2 乙酰CoA合成酶（ACS）
        1.2.3 國內(nèi)外研究現(xiàn)狀
    1.3 cDNA末端快速擴增技術(shù)
    1.4 本章小結(jié)
第二章 特氏杜氏藻ACS基因的克隆及生物信息學(xué)分析
    2.1 引言
    2.2 實驗材料與儀器
        2.2.1 藻種和培養(yǎng)液
        2.2.2 質(zhì)粒和菌種
        2.2.3 試劑
        2.2.4 主要儀器設(shè)備
        2.2.5 常用試劑的配制
    2.3 實驗方法
        2.3.1 特氏藻的培養(yǎng)
        2.3.2 特氏藻總 RNA 的提取與測定
        2.3.3 PCR擴增目的基因
    2.4 生物信息學(xué)分析DtACS
        2.4.1 DtACS的物理化學(xué)性質(zhì)分析
        2.4.2 DtACS氨基酸序列相似性搜索和保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測
        2.4.3 DtACS亞細胞定位分析
        2.4.4 DtACS同源性比對以及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建
        2.4.5 DtACS結(jié)構(gòu)預(yù)測
    2.5 結(jié)果與討論
        2.5.1 DtACS cDNA克隆
        2.5.2 生物信息學(xué)分析DtACS
    2.6 本章小結(jié)
第三章 構(gòu)建原核表達載體pET-32a（+）-DtACS和工程菌pET-32a（+）-DtACS-BL21（DE3）
    3.1 引言
    3.2 實驗材料與儀器
    3.3 目的條帶的擴增、分離、回收、連接、轉(zhuǎn)化與測序
        3.3.1 擴增目的條帶
        3.3.2 回收目的DNA片段
        3.3.3 線性化載體的制備
        3.3.4 純化酶切產(chǎn)物
        3.3.5 連接
        3.3.6 轉(zhuǎn)化連接產(chǎn)物
        3.3.7 篩選陽性克隆
        3.3.8 雙酶切鑒定
        3.3.9 測序與保存
        3.3.10 轉(zhuǎn)化至E.coli BL21 （DE3）感受態(tài)細胞
    3.4 結(jié)果與討論
        3.4.1 菌液PCR進行陽性克隆檢測
        3.4.2 雙酶切鑒定
    3.5 本章小結(jié)
第四章 在大腸桿菌中異源表達純化重組DtACS
    4.1 引言
    4.2 實驗材料
    4.3 異源表達純化重組DtACS
        4.3.1 確定最適表達條件
        4.3.2 SDS聚丙烯酰氨凝膠電泳流程
        4.3.3 大量表達重組蛋白
        4.3.4 純化重組蛋白
    4.4 重組DtACS酶活力的測定
        4.4.1 酶活力測定反應(yīng)體系
        4.4.2 Bradford法測定蛋白濃度
        4.4.3 比酶活計算公式
        4.4.4 DtACS動力學(xué)分析以及其最適pH值和溫度的測定
    4.5 結(jié)果與討論
        4.5.1 蛋白表達預(yù)實驗
        4.5.2 重組蛋白純化
        4.5.3 DtACS酶活測定
    4.6 本章小結(jié)
結(jié)論與展望
    結(jié)論
    創(chuàng)新點
    展望
參考文獻
攻讀碩士學(xué)位期間取得的研究成果
致謝
答辨委員會對論文的評定意見


【參考文獻】：
期刊論文
[1]產(chǎn)油微生物的研究及其應(yīng)用[J]. 易紹金,鄭義平.  中外能源. 2006(02)
[2]產(chǎn)油微生物油脂生物合成與代謝調(diào)控研究進展[J]. 劉波,孫艷,劉永紅,趙宗保.  微生物學(xué)報. 2005(01)



本文編號：2924392