發(fā)布時(shí)間：2020-11-15 15:54

　　 本論文通過敲除膜結(jié)合葡萄糖酸脫氫酶(gluconate dehydrogenase,GADH)和2-酮基葡萄糖脫氫酶(2-ketoglucose dehydrogenase,2KGDH)的基因,驗(yàn)證其在變形假單胞菌生物合成2-酮基葡萄糖酸(2-ketogluconic acid,2KGA)中的作用,同時(shí)嘗試構(gòu)建以變形假單胞菌為底盤細(xì)胞的生產(chǎn)葡萄糖酸(gluconic acid,GA)的工程菌株。GA是一種具有多種物理和化學(xué)特性的有機(jī)酸,廣泛應(yīng)用于食品、飲料、化工、制藥、紡織、皮革、建筑等行業(yè)。本論文以國內(nèi)2KGA工業(yè)生產(chǎn)用菌變形假單胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)JUIM01為研究對(duì)象,首先利用LA-PCR(Long and accurate polymerase chain reaction)技術(shù)克隆編碼GADH的gad操縱子的全長序列,利用在線工具對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析;其次,利用重疊PCR、無痕敲除和同源重組技術(shù),分別構(gòu)建gad操縱子結(jié)構(gòu)基因gndS、gndL和gndC缺失菌株JUIM01ΔgndS、JUIM01ΔgndL和JUIM01ΔgndC;最后,在JUIM01ΔgndL的基礎(chǔ)上,敲除編碼2KGDH的基因2kgdH,構(gòu)建gndL與2kgdH基因雙敲除菌株JUIM01ΔgndLΔ2kgdH,并對(duì)原始菌株和基因敲除菌株的2KGA發(fā)酵特性進(jìn)行比較,從而確定變形假單胞菌2KGA的合成途徑,同時(shí)也為葡萄糖酸高效生產(chǎn)工程菌株的構(gòu)建提供一定理論依據(jù)。主要研究結(jié)果如下:(1)利用LA-PCR技術(shù),從變形假單胞菌JUIM01中克隆了含有g(shù)ad操縱子全長序列的4112 bp的核酸片段。經(jīng)分析,gad操縱子具有三個(gè)結(jié)構(gòu)基因gndS、gndL和gndC,核苷酸序列長度分別為753 bp、1788 bp和1314 bp,分別編碼膜結(jié)合GADH的小亞基(GndS)、脫氫酶亞基(GndL)和細(xì)胞色素c亞基(GndC)。變形假單胞菌gad操縱子的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)位于其結(jié)構(gòu)基因gndS上游80 bp處的非編碼區(qū)中,-10區(qū)被預(yù)測為5′-GTCTAAGCT-3′,-35區(qū)被預(yù)測為5′-TTGTTC-3′;終止子區(qū)處于其下游的非編碼區(qū)中,終止子為富含GC的反向重復(fù)序列,能夠形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)(GGGCCGC-nt4-GCGGCCC)。(2)構(gòu)建了基因敲除菌株JUIM01ΔgndS、JUIM01ΔgndL和JUIM01ΔgndC。發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果表明:基因gndS或gndC的敲除對(duì)變形假單胞菌的2KGA和GA的生產(chǎn)能力沒有影響,基因gndL的敲除僅使其2KGA的生產(chǎn)水平降低了15%,這表明在變形假單胞菌JUIM01中可能存在其它的2KGA合成通路。(3)構(gòu)建了基因敲除菌株JUIM01Δ2kgdH和JUIM01ΔgndLΔ2kgdH。發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果表明:基因2kgdH的敲除使變形假單胞菌的2KGA的最高產(chǎn)量降低了5.4%;gndL和2kgdH基因的雙敲除使變形假單胞菌的2KGA合成途徑得以阻斷,從而使大量的GA(57.14 g/L)積累于發(fā)酵液中。
【學(xué)位單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：TQ921.2
【部分圖文】：

圖 1.1 葡萄糖酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)式 1.1 Chemical structure of glucon法及研究現(xiàn)狀、藥品、食品以及飲料產(chǎn)品的產(chǎn)的有機(jī)酸已經(jīng)成為全球市場悠久的歷史，于 1870 年被olliard 在絲狀真菌黑曲霉的體上可分為化學(xué)合成法、微生 GA即在金屬催化劑存在的條件境下，利用 Pt、Pd 和 Au 納米以在多相體系中催化氧化葡

圖 1.2 常規(guī)的葡萄糖酸生產(chǎn)流程Fig. 1.2 Conventional gluconic acid production proces應(yīng)用及發(fā)展前景羥基和羧基的多功能聚羥基烴碳酸和溫和酸，GA 及其鹽類（如堿金屬鹽尤其是其鈉鹽）和葡萄、制藥、紡織、洗滌劑、皮革、攝影、建筑等行具有低毒性、低腐蝕性以及能夠與二價(jià)和三價(jià)金等特點(diǎn)，葡萄糖酸鈉已被美國食品和藥物管rug Administration，US-FDA）認(rèn)定為 GRAS（Gene認(rèn)的安全的食品添加劑[2]。性質(zhì)在于它具有極強(qiáng)的與鈣、鐵、銅、鋁及其他性和濃堿溶液中，超過了其他已知的螯合劑如 ED

圖 1.3 假單胞菌中 2KGA 的合成代謝與分解代謝途徑Fig. 1.3 The anabolism and catabolism pathway of 2KGA in Psedomonas1.2.3 膜結(jié)合 GADH 的相關(guān)研究1.2.3.1 膜結(jié)合 GADH 的來源膜結(jié)合 GADH 存在于很多氧化型細(xì)菌的細(xì)胞質(zhì)膜中，如假單胞菌（Pseudomonas）、歐文氏菌（Erwinia）、克雷伯氏菌（Klebsiella）、葡糖桿菌（Gluconobacter）、醋酸桿菌（Acetobacter）、沙雷氏菌（Serratia）等[73]�？纱呋姆磻�(yīng)為：GA+電子受體→2KGA+還原性電子受體。1.2.3.2 膜結(jié)合 GADH 的結(jié)構(gòu)和功能Shinagawa 等[74]從粘質(zhì)沙雷氏菌（S. marcescens）IFO 3054 中純化了 GADH，由三個(gè)分子質(zhì)量分別為 68000 Da、52500 Da 和 15500 Da 的亞基組成；Matsushita等[75]從銅綠假單胞菌（P. aeruginosa）IFO 3445 的細(xì)胞膜中得到了 GADH，其三
【參考文獻(xiàn)】

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2 陶果;信吉閣;肖晶;劉海京;成文敏;查星琴;曾養(yǎng)志;;基因敲除技術(shù)最新研究進(jìn)展及其應(yīng)用[J];安徽農(nóng)業(yè)科學(xué);2013年29期

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本文編號(hào)：2884941