刺梨(Rose roxburghii Tratt)又名文先果、送春歸,是薔薇科薔薇屬落葉灌木,主要生長(zhǎng)于我國(guó)西南山區(qū),特別在貴州地區(qū)分布最為廣泛。刺梨果實(shí)富含黃酮、多糖、維生素、超氧化物歧化酶和有機(jī)酸等營(yíng)養(yǎng)元素,傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)也用于治療糖尿病、癌癥、積食腹脹、高血脂、高血壓和維生素C缺乏癥等,是一種典型的藥食同源的水果。多糖作為刺梨最主要的活性成分之一,但目前關(guān)于刺梨多糖的結(jié)構(gòu)特征、降血糖活性、作用機(jī)理和構(gòu)效關(guān)系尚不清楚。本論文選擇刺梨果為實(shí)驗(yàn)原料,首先研究了刺梨多糖的提取、分離純化、理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)特征;其次,通過(guò)體外化學(xué)實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)相結(jié)合,深入探究了刺梨多糖的降血糖活性和對(duì)腸道微生物的影響;最后,將一種純化的刺梨多糖(RTFP-3)作為表面修飾劑和調(diào)控劑,成功制備出刺梨多糖納米硒復(fù)合物(RP3-SeNPs),研究了其對(duì)氧化損傷大鼠胰島瘤(INS-1)細(xì)胞的保護(hù)作用和機(jī)理,可開(kāi)發(fā)成一種新型的硒補(bǔ)充劑,應(yīng)用于糖尿病的治療。主要研究結(jié)果如下:(1)采用熱水浸提法從刺梨果中提取刺梨粗多糖,命名為RTFP,經(jīng)陰離子交換柱層析分離純化得到四個(gè)組分,分別命名為RTFP-1、RTFP-2、RTFP-3和RTFP-4,其中RTFP-1和RTFP-3得率最高,分別占RTFP的12.30%和23.84%(w/w)。高效凝膠滲透色譜(HPGPC)分析表明RTFP-1和RTFP-3的平均分子量大小分別為128.7和67.2 kDa;甲基化和1D/2D NMR分析表明,RTFP-1主要由→5)-α-L-Araf-(1→、→6)-α-D-Galp-(1→、→3)-α-D-GalpNAc-(1→、→4)-β-D-GalpA-(1→、β-D-Xylp-(1→和α-D-Glcp-(1→等糖苷鍵組成;RTFP-3主要由→6)-α-D-Galp-(1→、→4)-α-D-GalpA-(1→、→5)-α-L-Araf-(1→、→3,4)-β-L-Fucp-(1→、→4)-β-D-Glcp-(1→和β-D-Glcp-(1→等糖苷鍵組成。(2)采用體外化學(xué)和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)刺梨多糖的降血糖活性,結(jié)果表明RTFP-1和RTFP-3均具有α-葡萄糖苷酶抑制活性,其半數(shù)抑制濃度(IC_(50))值分別為2.04和4.15mg/mL,且二者均屬于混合型抑制類(lèi)型。RTFP-1和RTFP-3存在時(shí),酶-抑制劑解離常數(shù)K_i值分別為5.104和19.889 mg/mL,酶-抑制劑-底物解離常數(shù)K_(is)值分別為0.421和7.007 mg/mL。RTFP-1和RTFP-3對(duì)α-葡萄糖苷酶的熒光猝滅類(lèi)型屬于靜態(tài)猝滅,兩者與α-葡萄糖苷酶之間的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)分別為1.04和1.44。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,RTFP-3可顯著提高胰島素抵抗HepG2(IR-HepG2)細(xì)胞的葡萄糖吸收能力、丙酮酸激酶與己糖激酶的活性,下調(diào)葡萄糖6磷酸酶mRNA表達(dá)量,促進(jìn)IR-HepG2細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取和肝糖原的合成。(3)以刺梨多糖RTFP-3(2 mg/mL)作為調(diào)控劑,采用單步綠色原位合成方法,制備得到穩(wěn)定均一的刺梨多糖納米硒(RP3-SeNPs)溶液,平均粒徑為104.5 nm;RP3-SeNPs能夠有效降低氧化損傷INS-1細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)的產(chǎn)生和細(xì)胞內(nèi)線(xiàn)粒體跨膜電位ΔΨm下降,抑制細(xì)胞內(nèi)caspase-3,caspases-8和caspsae-9的過(guò)度激活,以及下調(diào)解偶聯(lián)蛋白-2(UCP-2)的蛋白表達(dá)。結(jié)果表明RP3-SeNPs能夠抑制H_2O_2誘導(dǎo)的INS-1細(xì)胞凋亡,保護(hù)INS-1細(xì)胞的正常功能。(4)通過(guò)體外模擬口腔、胃部、小腸和大腸消化實(shí)驗(yàn),研究刺梨多糖RTFP-3在消化過(guò)程中的變化,結(jié)果發(fā)現(xiàn)唾液淀粉酶對(duì)刺梨多糖RTFP-3的相對(duì)分子質(zhì)量無(wú)影響,在模擬胃、小腸消化體系中,多糖的相對(duì)分子質(zhì)量發(fā)生改變,從67.59 kDa降低為44.22 kDa,還原糖含量從0.503 mM增加為1.744 mM,但是在整個(gè)模擬消化過(guò)程中,沒(méi)有檢測(cè)到游離單糖;在模擬大腸消化酵解階段,經(jīng)過(guò)48 h酵解,RTFP-3使酵解液中的總短鏈脂肪酸含量從23.49 mM增加到44.29 mM。此外,RTFP-3還可以改變腸道微生物的群落組成,RTFP-3使微生物組成中厚壁菌門(mén)和擬桿菌門(mén)的比值從14.89降低到4.68,提高腸道中有益菌的豐度。(5)以自發(fā)性糖尿病db/db小鼠為模型,膳食干預(yù)8周后,結(jié)果表明,RTFP可以顯著降低db/db小鼠的體重、空腹血糖、空腹胰島素和高血脂癥狀,RTFP還可以下調(diào)模型組小鼠肝臟中糖異生和脂肪生成關(guān)鍵基因的表達(dá)水平(如G6Pase、FAS、ACC-1、SREBP-1c和PPAR-γ),降低小鼠肝臟組織中脂肪的堆積;采用16S rRNA基因測(cè)序技術(shù)對(duì)不同處理組小鼠的腸道微生物組成和生物多樣性進(jìn)行分析,RTFP的干預(yù)不僅逆轉(zhuǎn)了糖尿病小鼠腸道內(nèi)的厚壁菌門(mén)與擬桿菌門(mén)相對(duì)豐度的比值,而且提高了小鼠腸道中Bacteroidaceae、Bacteroidaceae S24-7 group和Lactobacillaceae等有益菌的豐度,降低了Enterocaccaceae、Desulfovibrionaceae等有害菌的豐度。
【學(xué)位單位】：華南理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類(lèi)】：TQ464.1
【部分圖文】：

2-8 RTFP-1 和 RTFP-3 的 SEM 圖像：A 和 C 為在 500 倍下 SEM 圖；B 和 D 為在 2倍下 SEM 圖g. 2-8 SEM of RTFP-1, 500× magnification (A), 2000× magnification (B); SEM of RTF500× magnification (C), 2000× magnification (D).4.6 高碘酸氧化與 Smith 降解如圖 2-9A 所示，高碘酸鈉標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的線(xiàn)性回歸方程式為 y=9.42x+0.0153，其中 223 nm 處的吸光值，x 為對(duì)應(yīng)的高碘酸鈉濃度（mM）。根據(jù)高碘酸氧化的原理可知mol 的(1→)或(1→6)糖苷鍵對(duì)應(yīng)的糖殘基可消耗 2 mol 的高碘酸，生成 1 mol 的甲mol 的(1→2)或(1→4)糖苷鍵對(duì)應(yīng)的糖殘基可消耗 1mol 高碘酸，無(wú)甲酸生成；而(1→苷鍵對(duì)應(yīng)的糖殘基，不消耗高碘酸。然后結(jié)合高碘酸鈉標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程，以及 RTF RTFP-3 的高碘酸消耗量和甲酸的生成量，計(jì)算可知 1 mol 的 RTFP-1 和 RTFP-3 己

RTFP-1 的1H 圖譜)1H NMR; (B)1332(A)；13C 圖譜(B)；1H-1H COSY 圖譜(C)；HMBC 圖譜(E)C NMR; (C)1H-1H COSY; (D) HSQC and (E)of RTFP-1HSH

圖 2-12 RTFP-3 的1H 圖譜(A)；13C 圖譜(B)；HSQC 圖譜(C)Fig. 2-12 (A)1H NMR; (B)13C NMR; (C) HSQC spectra of RTFP-3表 2-7 RTFP-3 的1H 和13C 譜中的化學(xué)位移Table 2-7 Chemical shifts of assignments in the1H and13C NMR spectra of RTFP-3Sugar residue C1/H1 C2/H2 C3/H3 C4/H4 C5/H5 C6/H6→6)-α-D-Galp-(1→a99.784.9468.793.8881.473.5068.513.9772.813.6170.733.794)-α-D-GalpA-(1→b100.924.6174.663.5873.493.6378.754.3370.734.81173.48-→5)-α-L-Araf-(1→c109.355.1184.083.9777.804.6182.464.05,4.0768.513.97,3.61-/-3,4)-β-L-Fucp-(1→d104.524.50-/-81.474.0881.093.99-/-16.651.11,1.13
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2874968