在谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)中的L-亮氨酸合成途徑中,最后一步反應是由支鏈氨基酸轉氨酶(BCAT)催化的氨基轉移反應。然而BCAT同時催化三種支鏈氨基酸(BCAAs)與相應α-酮酸之間的氨基轉移反應,造成了另外兩種BCAAs始終以副產物的形式存在于發(fā)酵液中,為后續(xù)分離提取增加了難度。所以本文以L-亮氨酸產生菌C.glutamicum FA-1為出發(fā)菌株,通過改造轉氨基途徑篩選對L-亮氨酸有特異催化合成活性的轉氨酶,考察其對L-亮氨酸的作用。主要研究結果如下:(1)通過同源重組原理敲除出發(fā)菌株C.glutamicum FA-1中編碼BCAT的ilv E基因,研究其對L-亮氨酸和L-纈氨酸合成的影響。與出發(fā)菌株C.glutamicum FA-1相比,重組菌株C.glutamicum FA-1Δilv E的葡萄糖平均消耗速率大大降低,并且L-亮氨酸和L-纈氨酸的產量分別降低了87.1%和92.4%,而丙酮酸等副產物由于代謝通路的阻斷而增加。另外,BCAT的失活導致重組菌株對L-亮氨酸和L-纈氨酸的酶活力分別降低了94.4%和93.0%,但是重組菌株只表現出L-纈氨酸營養(yǎng)缺陷,由此猜測體內存在其他的轉氨酶參與L-亮氨酸的合成以滿足菌株正常生長的需求。(2)為驗證重組菌株體內仍有其他轉氨酶參與L-亮氨酸的合成,克隆及表達C.glutamicum來源的8種轉氨酶基因,結果發(fā)現只有重組菌株C.glutamicum FA-1Δilv E/p EC-XK99E-asp B表現出L-亮氨酸催化合成活性,L-亮氨酸的產量達20.81 g·L-1,并且不影響L-纈氨酸的合成。與對照菌株C.glutamicum FA-1Δilv E相比,L-亮氨酸的酶活力提高了537%,證實了在ilv E-菌株體內,確實存在著除BCAT外的催化L-亮氨酸合成的轉氨酶。由此推測C.glutamicum FA-1Δilv E的正常生長不依賴于L-亮氨酸可能是由于asp B基因的存在,其在體內催化合成L-亮氨酸,可以滿足菌株生長的需求而不需要額外添加。(3)通過構建ilvE-aspB-雙突變體菌株,研究其對L-亮氨酸合成的影響。結果顯示雙突變體菌株C.glutamicum FA-1ΔilvE ΔaspB不再具有L-亮氨酸催化合成活性,并且表現出L-天冬氨酸和L-亮氨酸雙重缺陷,證明C.glutamicum FA-1ΔilvE的正常生長不依賴于L-亮氨酸是由于aspB基因的存在,其可以滿足菌株正常生長對L-亮氨酸的需求。由于BCAT和AspB的失活擾亂了糖酵解途徑和TCA循環(huán),使得菌體的生長及代謝緩慢,副產物(L-丙氨酸、L-谷氨酸和丙酮酸)含量有所增加,但L-纈氨酸產量不受影響。由于重組菌株C.glutamicum FA-1ΔilvE ΔaspB消除了體內L-亮氨酸的影響,對下一步篩選特異性的轉氨酶提供了基礎,用于下一步實驗。(4)為篩選出對L-亮氨酸具有特異催化合成活性的轉氨酶,在雙突變體菌株中克隆及表達26種外源轉氨酶基因,結果表明轉氨酶Ectyr B和Ecavt A分別僅具有L-亮氨酸和L-纈氨酸催化合成活性,并且重組菌株FA-1Δilv EΔasp B/p EC-XK99E-Ectyr B發(fā)酵生產L-亮氨酸的產量為18.55 g·L-1;另外,來源不同的BCATs均具有L-亮氨酸和L-纈氨酸催化合成活性,并且它們的催化能力相近,而其他的轉氨酶未檢測到L-亮氨酸和/或L-纈氨酸催化合成活性。(5)通過對所使用的轉氨酶蛋白進化分析及序列比對,結果表明所有的BCATs位于進化樹的同一分支,親緣關系較近,并且推測的酶活性位點及結合底物和輔助因子的位點一致;另外EctyrB位于單獨的一個分支,與其他的轉氨酶親緣關系比較遠;而CgaspB與其他AspATs位于不同的分支,并且通過序列比對發(fā)現CgaspB與其他AspATs的活性位點一致,但結合底物及輔助因子PLP的殘基是獨特的,它們之間的親緣關系比較遠。由于CgaspB和EctyrB具有專一的L-亮氨酸催化特性,因此它們可以用于構建L-亮氨酸產生菌,優(yōu)化L-亮氨酸的生產。
【學位單位】：江南大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：TQ922
【部分圖文】：

圖 3-3 目的重組菌株的篩選及驗證Fig. 3-3 Screening and verification of recombinant strain C.glutamicumFA-1ΔilvE 的篩選，B 重組菌株 C.glutamicumFA-10 DNAMarker，1 1#單菌落，2 2#單菌落，3 3#單菌落，4 4#單菌落，-L 和 ilvE-R 為引物，菌落為模板擴增片段；圖 B 中 M DL10000 D#

圖 3-6 重組質粒的單、雙酶切瓊脂糖凝膠電泳圖Fig. 3-6Agarose gel electrophoresis of different recombinant plasmids000 DNA Marker，1-2 pEC-XK99E-Cgl0814 單、雙酶切產物，3-4 pEC-X5-6pEC-XK99E-avtA 單、雙酶切產物，7-8pEC-XK99E-Cgl2309 單、雙酶Cgl2844 單、雙酶切產物，11-12 pEC-XK99E-aroT 單、雙酶切產物，13-1

pK18mobsacB-ΔaspB 單、雙酶el electrophoresis of plasmid pKAMarker，1-2 pK18mobsacB- FA-1 ΔilvE ΔaspB 的構建A-1 ΔilvE ΔaspB 的構建依。結果如圖 3-10 所示，表
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本文編號：2873328